Summary
نقدم هنا بروتوكولا للحصول على شرائح جذع الدماغ السمعية غير الإكليلية من جنين الدجاج للتحقيق في خصائص التوتر ومسارات النمو داخل شريحة جذع دماغ واحدة. وتشمل هذه الشرائح أقساما سهمية وأفقية وأفقية/عرضية تشمل مناطق تونوبية أكبر داخل مستوى شريحة فردي مقارنة بالمقاطع الإكليلية التقليدية.
Abstract
جنين الدجاج هو نموذج حيواني مقبول على نطاق واسع لدراسة جذع الدماغ السمعي ، ويتكون من الدوائر الدقيقة عالية التخصص والطوبولوجيا العصبية الموجهة بشكل مختلف على طول محور تونوتوبيا (أي تردد). يسمح المحور التونوتوبي بالترميز المنفصل للأصوات عالية التردد في المستوى الإنسي السطحي والترميز منخفض التردد في المناطق الجانبية المذنبة. تقليديا ، تسمح شرائح جذع الدماغ الإكليلي من الأنسجة الجنينية بدراسة الصفيحة الفردية ذات التردد المتساوي النسبية. على الرغم من أنها كافية للتحقيق في الأسئلة التشريحية والفسيولوجية المتعلقة بمناطق التردد المتساوي الفردية ، إلا أن دراسة التباين التونوتوبي وتطوره عبر مناطق جذع الدماغ السمعية الأكبر محدودة إلى حد ما. يبلغ هذا البروتوكول عن تقنيات تقطيع جذع الدماغ من أجنة الدجاج التي تشمل تدرجات أكبر من مناطق التردد في جذع الدماغ السمعي السفلي. يسمح استخدام طرق التقطيع المختلفة لأنسجة جذع الدماغ السمعية للدجاج بإجراء تجارب كهروفسيولوجية وتشريحية داخل شريحة جذع دماغ واحدة ، حيث يتم الحفاظ على تدرجات أكبر من الخصائص التونومية والمسارات التنموية بشكل أفضل من الأقسام الإكليلية. تسمح تقنيات التقطيع المتعددة بتحسين التحقيق في الخصائص التشريحية والفيزيائية الحيوية والطحنية المتنوعة للدوائر الدقيقة السمعية لجذع الدماغ السمعي.
Introduction
جنين الدجاج هو نموذج بحثي قيم لدراسة الأسئلة البيولوجية الأساسية في العديد من المجالات العلمية المتنوعة بما في ذلك بيولوجيا الخلية وعلم المناعة وعلم الأمراض والبيولوجيا العصبية التنموية. تعد الدوائر الدقيقة لجذع الدماغ السمعي للدجاج مثالا ممتازا على دائرة عالية التخصص يمكن فهمها من حيث التشكل السمعي وعلم وظائف الأعضاء. على سبيل المثال ، وصف Rubel and Parks (1975) لأول مرة الاتجاه التونوتوبي (أي تدرج التردد) لنواة الدجاج magnocellularis (NM) والنواة الصفيحية (NL) كدالة خطية عبر محور النوى ، موجهة ~ 30 درجة فيما يتعلق بالمستوى السهمي. تقوم الخلايا العصبية الفردية في NM و NL بتشفير أفضل تردد صوتي لها - يعرف باسم ترددها المميز (CF) - على طول المستوى الإنسي السطحي إلى المنطقة الجانبية. توجد الخلايا العصبية عالية الحساسية للتردد في المنطقة الإنسية على السطح وتوجد الخلايا العصبية منخفضة التردد الحساسة بشكل جانبي. على هذا النحو ، استخدمت طرق التشريح التقليدية لأنسجة جذع الدماغ السمعية لدراسة الخصائص التونومية شرائح إكليلية متتالية. في الواقع ، تم إنشاء الدوائر السمعية الدقيقة لأجنة الدجاج النامية كنظام نموذجي لدراسة معالجة الإشارات للوظائف السمعية التونوتوبية من خلال شرائح جذع الدماغ المتتالية من المستوى الإكليلي إلى السطح لعقود1،2،3،4،5،6.
ومع ذلك ، فإن التنظيم التونوتوبي ل NM و NL معقد طوبولوجيا ومورفولوجيا. يتم توزيع مدخلات الأعصاب السمعية بحيث تنتهي مدخلات CF العالية في هياكل تشبه المصباح النهائي تغطي ما لا يقل عن ربع المحيط الجسدي لخلية NM الإضافية. على العكس من ذلك ، لا يتم تنظيم مدخلات CF المنخفضة مع محطات طرفية تشبه المصباح النهائي ولكن مع نقاط اشتباك عصبي متعددة على التشعبات من الخلايا العصبية NM. تنتهي مدخلات CF الوسطى كلمبة نهاية ونقاط اشتباك عصبي تشبه البوتون 4,7,8,9,10,11,12. في NL ، يتضح التدرج التغصني النمطي للغاية ليس فقط في الطول المتغصن ولكن أيضا في العرض الشجيري. يتوافق هذا التدرج التغصني الفريد بشكل وثيق مع المحور التونومي. تخضع التشعبات لزيادة طولها بمقدار 11 ضعفا وزيادة عرضها بمقدار خمسة أضعاف من الخلايا العصبية عالية إلى منخفضة CF ، على التوالي6. للتغلب على مثل هذه التوزيعات المعقدة لهذه النوى في شرائح إكليلية ، يصف هذا البروتوكول نهج التشريح في المستويات السهمية والأفقية والأفقية / المستعرضة. توفر تقنيات التقطيع هذه أمثلة على أنسجة جذع الدماغ السمعية التي تظهر أقصى خصائص التوتر في مستوى شريحة فردي.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجان جامعة نورث وسترن المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) وتم تنفيذها وفقا للمعاهد الوطنية للمبادئ التوجيهية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. بروتوكولات تشريح وإعداد أنسجة جذع الدماغ متوافقة مع البروتوكولات السابقة 5,13.
1. التعامل مع البيض
- شراء البيض المخصب (Gallus gallus domesticus) من مورد حيواني محلي معتمد من IACUC.
- تخزين البيض فور وصوله في الثلاجة على حرارة 14 درجة مئوية واحتضانه في غضون 5 أيام.
ملاحظة: بقاء الجنين ينخفض بشكل كبير بعد 1 أسبوع. - تعقيم البيض مع 70 ٪ من الإيثانول قبل الحضانة في 38 ± 1 درجة مئوية والرطوبة ~ 50 ٪.
2. تكوين وإعداد السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF)
- امزج المواد الكيميائية التالية في 1 لتر من 18.2 MΩcm dH 2 O لإنشاء محلول مخزون ACSF 10x: كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 130 mM ، NaHCO3 (بيكربونات الصوديوم) 26 mM ، KCl (كلوريد البوتاسيوم) 2.5 mM ، NaH2PO4 (فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم) 1.25mM ، سكر العنب (D-(+)-glucose) 10 mM. احتفظ بمحلول المخزون في الثلاجة.
- تحضير MgCl 2 (كلوريد المغنيسيوم) 1 M و CaCl 2 (كلوريد الكالسيوم) 1 M المحاليل بشكل منفصل في 18.2 MΩcm dH2 O وتخزينها في الثلاجة.
- قبل الاستخدام مباشرة ، قم بتخفيف 10x ACSF إلى 1x وفقاعة باستمرار مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لمدة 15-20 دقيقة وأضف MgCl 2 و CaCl 2. لإعداد ACSF و dACSF (تشريح ACSF) ، اضبط على التركيز النهائي ل Mg 2 + 1 mM و Ca 2 + 3 mM و Mg 2 + 3 mM ، Ca 2 + 1 mM ، على التوالي.
- اضبط معدل الفقاعات ل ACSF بحيث يكون الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4 مع أسمولية بين 300 و 310 mOsm / L.
ملاحظة: إن وضع ACSF في حمام جليدي أثناء الفقاعات مفيد للحفاظ على درجة حرارة محلول منخفضة ، مما سيدعم السلامة الهيكلية للأنسجة أثناء التشريح.
3. أغاروز (5٪) إعداد كتلة
- امزج 5 غرام من الأغاروز في 100 مل من dACSF. استخدم حمام مائي 100 درجة مئوية أو ميكروويف لمدة 2-3 دقائق ، مع التحريك كل 30 ثانية لمنع الكتل حتى يذوب الأغاروز تماما ويبدأ في الفقاعات.
- يسكب الأغاروز المذاب في طبق بتري فارغ يصل سمكه إلى 5 مم ويحفظ في درجة حرارة الغرفة لضبطه. بعد الإعداد ، أغلق طبق بتري باستخدام بارافيلم وخزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- قطع الأغاروز إلى كتل مكعبة بشفرة حادة واستخدمها في وقت التشريح.
4. بروتوكول التشريح وعزل جذع الدماغ السمعي
- نظف منطقة التشريح باستخدام رذاذ محلول الكحول الإيثيلي بنسبة 70٪.
- قم بلصق كتلة الأغاروز الداعمة أو الزاوية على صينية الاهتزاز.
- اختر البيض من العمر المطلوب (E20 و E21 في هذا البروتوكول). تعامل مع البيض واحتضنه باتباع البروتوكولات المذكورة أعلاه كما في الخطوة 1.
- حدد موقع المساحة المملوءة بالهواء عن طريق وضع البيضة تحت ضوء ساطع (التشميع) والبحث عن هذه المساحة على الجانب الأكبر أو المستدير من البيضة.
- تأقلم البيض مع درجة حرارة الغرفة ، وكسر القشرة فوق المساحة المملوءة بالهواء ، وفضح كيس الغشاء.
- قم بعمل شق لطيف في الكيس لفضح المنقار.
- باستخدام مشرط ، اسحب الرقبة بلطف وأخرج من البيضة.
- سريع قطع رأس الرأس باستخدام مقص حاد.
- بعد قطع الرأس ، قم بتنظيف الرأس باستخدام dACSF المبرد بالثلج لإزالة الدم الزائد من وسادة التشريح.
- امسك الرأس ثابتا في dACSF المبرد بالجليد وقم بعمل شق ذيلي روسترو. ابدأ الشق خلف وبين العينين واتبع طول الرقبة المحصودة.
ملاحظة: قد تتطلب الأجنة الأصغر سنا ضغطا أقل أثناء إجراء الشق. - افصل الجلد لفضح الجمجمة.
- قطع الجمجمة خلف العين في خط الوسط إلى الاتجاه الجانبي. افعل ذلك لنصفي الكرة الأرضية.
ملاحظة: تساعد هذه الخطوة على فصل الجزء العلوي من الجمجمة عن الدماغ المرفق مع الحفاظ على أنسجة المخ سليمة5. - قطع الجزء العلوي من الجمجمة. ضع الشفرة خلف العينين وقم بإجراء قطع سريع.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى بذل جهد لقطع الجمجمة المرفقة بشكل نظيف. - اغمر الرأس في طبق من dACSF البارد.
- باستخدام زوج صغير من المقصات ، قم بعمل خط الوسط إلى الشقوق الجانبية في المنطقة الذيلية من الجمجمة لمحاولة فصل الدماغ عن الجمجمة دون التسبب في تلف الأنسجة.
- كشف بلطف جذع الدماغ والمخيخ. سحب المنطقة الظهرية من الجمجمة بأكملها ، وإزالة جذع الدماغ بعناية ، وفضحه بمساعدة فرشاة طلاء دقيقة مع زلاجة خفيفة. استخدم ملقط منحني لتنظيف جذع الدماغ من ربط الأنسجة والأوعية الدموية. إيلاء مزيد من الاهتمام لمنطقة العصبالقحفي 8 وتأكد من ترك طول قصير من الألياف العصبية السليمة على كلا الجانبين.
- افصل جذع الدماغ عن المخيخ عن طريق قطع السيقان وإزالة الأوعية الدموية بعناية. تقليم جذع الدماغ من الأوعية الدموية الإضافية.
ملاحظة: تأكد من تنفيذ الإجراء بأكمله في dACSF المبرد بالثلج باستمرار مع الأكسجين الكربوني (95٪ O 2/5٪ CO2).
5. تقطيع الاهتزاز
ملاحظة: في الخطوات التالية ، يجب دعم الجزء الخلفي من الأنسجة بقطعة مكعبة من الأغاروس.
- ضع شفرة الاهتزاز على طول المحور الأفقي وقم بلصق جذع الدماغ على صينية تقطيع. قم بلصق جانب السطح ، مع الحفاظ على المحور الذيلي للسطح عموديا للشرائح الإكليلية.
- حافظ على المحور الجانبي الإنسي عموديا للشرائح السهمية.
- قم بلصق الجانب البطني ، مع الحفاظ على المحور الظهري البطني عموديا للشرائح الأفقية.
- لتحقيق المستوى السهمي الأفقي الزاوي الحاد ، قم بلصق الجانب البطني لجذع الدماغ ، مع الحفاظ على المحور البطني الظهري عموديا على سطح الوتر السفلي لكتلة الأغاروز ، والذي يتم قطعه بزاوية 45 درجة. قم بلصق السطح المقابل لكتلة الأغاروز التي تواجه صينية التقطيع واحتفظ بالمحور الذيلي السطحي موازيا لحافة الشفرة.
6. التعامل مع القطع الهشة أو الكبيرة من أنسجة جذع الدماغ
- في نهج بديل للخطوة 5 ، اغمر جذع الدماغ المعزول في أغاروز درجة انصهار منخفضة (LMP) بنسبة 4٪ عند ~ 40 درجة مئوية في طبق بتري 35 مم × 10 مم.
- بعد صب الأغاروز على جذع الدماغ المغمور ، ضع طبق بتري على الجليد لتصلبه. اقطع كتلة الأغاروز التكعيبية باستخدام جذع الدماغ المدمج باستخدام شفرة حلاقة حادة.
- قم بلصق كتلة الأغاروز LMP على جانبها السطحي ، مع الحفاظ على محور جذع الدماغ الذيلي عموديا.
- خذ شرائح إكليلية حتى يمكن تصور منطقة NM.
- قم بإزالة كتلة الأغاروز من الغراء بشفرة حادة. لاكتشاف النوى ، ضع بلطف 0.5 ميكرولتر من الصبغة (أزرق تولويدين أو برتقالي G) على NM بإبرة دقيقة.
- أعد تركيب هذه الكتلة على صينية التقطيع للشرائح السهمية أو الأفقية وحدد النوى فيما يتعلق بالمنطقة الملطخة.
- للحصول على أفضل أداء، اضبط سرعة تقطيع الاهتزاز على 4 - 5 (~ 30 ± 4 مم/دقيقة)، وتردد الاهتزاز عند 85-87 هرتز، وسعة التقطيع عند 4-6 (~ 1 ± 0.2 مم).
- بعد تقسيم جذع الدماغ ، ضع شرائح 200-300 ميكرومتر التي تم جمعها بالتتابع في غرفة شريحة متاحة تجاريا لتحقيق التوازن لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في ACSF ، فقاعية مستمرة بمزيج من 95٪ O 2/5٪ CO 2 (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4 ، الأسمولية 300-310 mOsm / L). في هذه الظروف ، تظل الشرائح قابلة للحياة حتى 5-6 ساعات.
7. الفيزيولوجيا الكهربية: إجراء المشبك التصحيح
- انقل شريحة جذع الدماغ إلى غرفة التسجيل مع التروية المستمرة ل ACSF المؤكسج بالكربوهيدرات ~ 1.5 ± 0.5 مل / دقيقة.
- سحب ماصات التصحيح مع مجتذب ماصة دقيقة من قطر الطرف 1-2 ميكرومتر والمقاومة في حدود 3-6 MΩ.
- املأ الماصات بمحلول داخلي قائم على K-Gluconate (لتسجيل المشبك الحالي).
- لاختبار الخصائص العصبية عبر المناطق التونوتوبية المختلفة داخل الشريحة، حدد موقع الخلايا العصبية في طرفي مستوى الشريحة واقترب من قطب التسجيل.
- الحفاظ على ضغط الهواء الإيجابي عند طرف الماصة أثناء الاقتراب من الخلايا العصبية.
- تحرك نحو السوما حتى يتم تصور المسافة البادئة على الخلايا العصبية. نفذ الخطوتين التاليتين بسرعة.
- اصنع ختم جيجا أوم (1 GΩ) عن طريق إطلاق ضغط هواء إيجابي.
- احتفظ بإعداد مكبر الصوت في وضع مشبك الجهد وقم بتصحيح إزاحة الماصة على أنها صفر pA. قم بإجراء اختبار ختم (نبضة اختبار 10 mV عند 100 هرتز). ضع ضغطا سلبيا على الهواء لتمزيق رقعة صغيرة من الغشاء العصبي.
- لاختبار الخصائص الجوهرية النشطة للخلايا العصبية السمعية ، قم بتطبيق حقن التيار الجسدي مفرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب.
ملاحظة: يمكن تصور أمثلة لهذا الإجراء في الفيديو التكميلي S1 و S2. يتم توفير تفاصيل هذا الإجراء في وسائل إيضاح الفيديو.
Representative Results
تم الحصول على جميع شرائح جذع الدماغ الموضحة هنا من أنسجة جذع الدماغ (~ 200-300 ميكرومتر) وتم تصويرها باستخدام بصريات تباين التداخل الموضوعي والتفاضلي (DIC) 5x. تم تركيب الكاميرا على المجهر التشريحي وتوصيلها بجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج للحصول على الصور (انظر جدول المواد). تم تصوير الجزء الداخلي من القمر الصناعي لهذه الأشكال (اللوحات اليمنى) باستخدام هدف غمر الماء المكبرة 60x. تم الحرص على ضمان تكبير جميع مناطق شريحة جذع الدماغ بالتساوي أثناء الحصول على الصور الرقمية. تم التقاط الصور الفوتوغرافية في السطوع والتركيز البؤري الأمثل. تم خياطة الصور الرقمية لشرائح جذع الدماغ بطريقة مستوية تعتمد على المساحة المتداخلة وتم استيرادها إلى كمبيوتر مكتبي لمزيد من التعديلات على السطوع والتباين والتدرج الرمادي. تم تحديد الدوائر الدقيقة الأساسية لجذع الدماغ السمعي للدجاج وفقا للعمل السابق1،2،5،13. تحت المجهر (الهدف 5x) ، تم تحديد النوى السمعية على أنها المنطقة المجاورة للألياف العصبية النخاعية الشديدة التي تدور حول كل نواة على حد سواء بشكل جانبي أو مضاد على طول المناطق الظهرية للشريحة.
يوضح الشكل 1 الأجزاء الإكليلية التقليدية لأنسجة جذع الدماغ (200-300 ميكرومتر) من جنين دجاج E21. تمثل الشرائح الإكليلية الأربع الموضحة هنا مناطق التردد متساوي التردد النسبية لنوى جذع الدماغ السمعي ، من المنطقة السمعية الأقل تليف الكيسي (الشكل 1A ، المذنب الجانبي) التي تتقدم إلى أعلى منطقة سمعية CF (الشكل 1D ، السطح الإنسي). بالنسبة لجميع الشرائح الإكليلية الأربع في الشكل 1A-D ، تظهر المناطق المكبرة من NM و NL المصنفة في العمود الأوسط ويتم تكبيرها (هدف 60x) على البصر الأيمن للوحة الشكل (a و b ، على التوالي ، في مجموعات الأقمار الصناعية). يوضح السهم في الشكل 1A ، B مدخلات الألياف العصبية السمعية ، ويظهر رأس السهم تشعب محاور NM على يسار الشريحة. ويبين الشكل 1C بنية نواة قوقعة قوقعة أخرى للطيور تعرف باسم النواة الزاوية (NA، سهم على اليسار ورأس سهم على اليمين). تظهر الشريحتان الإكليليتين الأكثر روستريا النواة الزيتية العليا (SON) الموجودة على طول المنطقة البطنية الجانبية للشريحة الإكليلية (الشكل 1C ، D ، الدوائر البيضاء المتقطعة).
يوضح الشكل 2 المقاطع السهمية من أنسجة جذع الدماغ (200-300 ميكرومتر) من جنين دجاج E21. وبالنسبة لجميع الشرائح السهمية الثلاث (الشكل 2A-C)، تظهر المناطق المكبرة من NM وNL المسماة NM وNL في العمود الأوسط وتكبيرها (الهدف 60x) على البصر الصحيح للوحة الشكل (a و b، على التوالي في صور الأقمار الصناعية). تم تحديد NM و NL حيث دخلت الألياف العصبية السمعية (الشكل 2A ، السهم الأوسط) إلى مجموعة الخلايا العصبية التي لوحظت عند تكبير أعلى (الشكل 2A ، الدوائر المتقطعة المتوسطة والصغيرة والبيضاء ورؤوس السهام) ويسلط الضوء على نقطة انطلاق المنطقة السمعية (الشكل 2A ، اليسار ، كبير ، دائرة متقطعة بيضاء ورأس السهم). تم تحديد SON في المنطقة الوردية الجانبية لأكثر الشرائح الجانبية (الشكل 2A ، دائرة صغيرة ، بيضاء ، متقطعة). ويبين الشكل 2 باء المناطق التونوتوبية الممتدة التي تحتوي على مناطق سمعية منخفضة نسبيا وعالية التليف الكيسي من NM و NL على طول المحور الذيلي السطحي (مناطق بيضاء محددة، انظر أيضا الجزء الداخلي من الساتل). ويبين الشكل 2C الخصلات المحورية الجانبية والمقابلة في الشريحة الأكثر إنسية ونقطة النهاية للمنطقة السمعية (السهمان الأيسر والأوسط). يتناقض اتجاه الشرائح الموضحة هنا مع الاتجاه التقليدي للشرائح كما هو موضح في الشكل 1 (أي الإكليل). تم تنفيذ ذلك لعرض الاتجاه الذي يستوعب بشكل أفضل نهج ماصة زجاجية مطلوبة للتسجيلات الكهروفسيولوجية.
للتأكد من أن منطقة كبيرة من محور التوتر تم تمثيلها في الشكل 2B ، تم إجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية للمشبك الحالي من الخلايا العصبية NM. يوضح الشكل 3 أوجه التشابه والاختلاف الوظيفية للخلايا العصبية NM الناضجة (E21) المسجلة من شريحة إكليلية (الشكل 3A ، B) وشريحة سهمية (الشكل 3C ، D ، الفيديو التكميلي S1 ، S2). تم اختيار اثنين من الخلايا العصبية NM من النهايات الإنسية والجانبية لشريحة إكليلية (على غرار الشريحة الموضحة في الشكل 1B) ، وتم اختيار اثنين من الخلايا العصبية NM من الأطراف السطحية والذيلية ل NM في شريحة سهمية (كما هو موضح في الشريحة الموضحة في الشكل 2B). يوضح الشكل 3A,B خصائص استجابة كهروفسيولوجية مماثلة لحقن التيار الجسدي (-100 pA إلى +200 pA ، +10 pA زيادات ، مدة 100 مللي ثانية). يظهر نمط إطلاق هاتين العصبتين NM اختلافات طفيفة في مستوى الشريحة هذا ، مما يشير إلى صفيحة متساوية التردد نسبية للخلايا العصبية NM متوسطة التردد. ويبين الشكل 3C,D أن أنماط إطلاق النار لها اختلافات جوهرية عبر المحور الذيلي السطحي، مما يشير إلى تدرج توتوني أعلى نسبيا من خلية عصبية NM منخفضة التردد (الشكل 3C) إلى خلية عصبية NM عالية التردد (الشكل 3D). قدمت كلتا العصبتين أنماط إطلاق النار النمطية الخاصة بهما كما ذكر سابقا14,15.
يوضح الشكل 4 المقاطع الأفقية من أنسجة جذع الدماغ (200-300 ميكرومتر) من جنين دجاج E21. وبالنسبة لكلتا الشريحتين الأفقيتين (الشكل 4A,B)، تظهر المناطق المكبرة من NM وNL المصنفين في العمود الأوسط وتكبير (هدف 60x) على المنظر الصحيح للوحة الشكل (a وb، على التوالي، في الوصلات الساتلية). في الشرائح الأفقية ، تم تحديد NM و NL نحو خط الوسط وتم نشر الخلايا العصبية على طول المحور الجانبي الإنسي (الشكل 4A و B والوسط والأبيض والمناطق المخططة المتقطعة). تظهر الصور المكبرة المدى الكبير للتدرج التونوتوبي. توجد الخلايا العصبية منخفضة التردد في المناطق الجانبية الكاودو والخلايا العصبية عالية التردد في المناطق الإنسية (الشكل 4A ، B ، اليمين ، الأقمار الصناعية). تظهر الألياف التي تمر عبر خط الوسط على طول المحور الذيلي السطحي الوصلات المعاكسة للنوى السمعية ، لكن تنظيم هذه الألياف ليس في مستوى بسيط. ومع ذلك ، يمكن للشرائح الزاوية الحادة من مقطع أفقي / عرضي أن تتبع هذه الألياف المحورية نحو المستوى السهمي. يوضح الشكل 5 شرائح من أنسجة جذع الدماغ السميكة 200-300 ميكرومتر بزاوية حادة (45 درجة) من مستوى أفقي. يمكن رؤية نوى جذع الدماغ السمعية عبر انتشار قطري كبير يبدأ من الشريحة الجانبية وينتهي عند الشريحة الأكثر إنسيابية (الشكل 5A-C ، الألواح الوسطى المصنفة ، المنطقة البيضاء المحددة). علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تصور الاتجاه الزاوي لمناطق NM و NL في شرائح متتالية غير متماثلة (الشكل 5A-C ، لوحات وسطى موسومة ، منطقة بيضاء ، متقطعة). تظهر الصور المكبرة (الهدف 60x) المحور التونوتوبي للنوى السمعية أثناء دورانها على طول المحور الإنسي من السطح إلى المحور الجانبي (الشكل 5A-C ، على اليمين ، الجزء الداخلي من القمر الصناعي). اتجاه الشرائح في الشكل 5 مشابه لتلك الموجودة في الشكل 2. إنها تتناقض مع العرض التقليدي للصور ولكنها أكثر ملاءمة للتجارب الكهروفسيولوجية.
الشكل 1: المقاطع التسلسلية الإكليلية التمثيلية لجذع الدماغ. (A-D) اليسار: شرائح من المحور الذيلي إلى المحور السطحي ، والنوى السمعية والألياف المتصلة المميزة بدائرة بيضاء متقطعة. الإدراج الأوسط هو منظر أكبر للمنطقة السمعية ، حيث تظهر النوى داخل دوائر متقطعة بيضاء a: NM و b: NL. تظهر الأسهم الألياف العصبية السمعية القريبة ، ويظهر رأس السهم تشعب محور NM في A ، B. يظهر السهم NA في C. تظهر الدائرة البيضاء المتقطعة الجانبية SON في C ، D. على اليمين: يظهر إدراج القمر الصناعي هذه النوى عند الهدف 60x: a: NM و b: NL. الاختصارات: NM = النواة المغنوسليلية; NL = نواة الصفيحة. NA = النواة الزاوية; SON = نواة أوليفارية متفوقة. LF = الخلايا العصبية منخفضة التردد نسبيا; MF = الخلايا العصبية متوسطة التردد; HF = الخلايا العصبية عالية التردد; D = الظهرية. L = جانبي; V = البطني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المقاطع التسلسلية السهمية التمثيلية لجذع الدماغ. (A-C) اليسار: شرائح من المحور الجانبي إلى المحور الإنسي مع النوى السمعية الموسومة في دائرة بيضاء متقطعة. تظهر الإضافة الوسطى نفس منطقة النوى السمعية في عرض أكبر، مع وضع علامة عليها داخل دوائر متقطعة بيضاء. (أ) دائرة بيضاء متقطعة في وسط الشريحة تبرز SON؛ سهم يظهر الألياف العصبية السمعية ورأس السهم الذي يظهر NA. بقعة سوداء داكنة في الطرف الأيمن من الشريحة هي قطعة أثرية تصويرية. يمكن رؤية مناطق المخيخ ظهريا إلى المنطقة السمعية في كل من الشريحتين A و B في اللوحة اليسرى. (ب) شريحة سهمية تم تغيير اتجاهها إلى المستوى الإكليلي (أثناء التقطيع). تم تحديد المنطقة السمعية بصبغة زرقاء (سهم أسود) وقطعت مرة أخرى في المستوى السهمي. (أ-ج) الإدراج الأوسط NM ومنطقة NL المميزة تحت خطوط بيضاء متقطعة. على اليمين: يظهر عرض القمر الصناعي a: NM و b: NL المرصود في تكبير موضوعي 60x. يظهر التدرج التونوتوبي LF و HF في النوى السمعية على طول المحور الوردي الذيلي. تظهر الأسهم التي تشير إلى المنطقة المظلمة في (C) ألياف NM شديدة النخاع تمر عبر خط الوسط عبر المحور الإنسي. تربط الألياف جانبي النوى السمعية. الاختصارات: NM = النواة المغنوسليلية; NL = نواة الصفيحة. NA = النواة الزاوية; SON = نواة أوليفارية متفوقة. LF = الخلايا العصبية منخفضة التردد نسبيا; HF = الخلايا العصبية عالية التردد; D = الظهرية. V = البطني; R = الروستروال. C = الذيلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التسجيلات الكهروفسيولوجية للاستجابة العصبية للحقن الحالية الجسدية (-100 pA إلى +200 pA ، +10 pA الزيادات ، مدة 100 مللي ثانية) في وضع المشبك الحالي. تم اختيار الخلايا العصبية للتسجيلات في نفس الشريحة ولكن في مناطق متقابلة للغاية من NM. (أ، ب) الاستجابات العصبية التمثيلية في شريحة إكليلية واحدة تشير إلى خصائص تردد متساوي النسبية مع اختلافات دقيقة. تمثل خصائص الاستجابة اثنين من الخلايا العصبية MF المختلفة المسجلة من أكثر المناطق الإنسية (A) والجانبية (B) من NM في شريحة إكليلية. (ج، د) تسجيلات عصبية تمثيلية من شريحة سهمية واحدة. تظهر التسجيلات استجابة LF NM نسبيا (C) واستجابة NM HF (D) ، مما يسلط الضوء على الاختلافات الموضوعية في التدرج التونوتوبي على طول داخل قسم سهمي واحد. الاختصارات: NM = النواة المغنوسليلية; LF = الخلايا العصبية منخفضة التردد نسبيا; MF = الخلايا العصبية متوسطة التردد; HF = الخلايا العصبية عالية التردد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الأقسام التسلسلية الأفقية التمثيلية لجذع الدماغ. (أ، ب) على اليسار: شرائح على طول المحور الظهري إلى البطني ، يتم تمييز النوى السمعية بدوائر بيضاء متقطعة. تربط الألياف العصبية القحفية8 النوى السمعية المميزة بالسهم. الإدراج الأوسط هو منظر أكبر لمنطقة النوى السمعية مع نوى سمعية مميزة تحت خطوط متقطعة بيضاء NM و NL تظهر المناطق. يمكن رؤية حركة طوبولوجية واضحة للنوى السمعية في A ، B. (أ، ب) على اليمين: عرض قمر صناعي كبير يظهر a: NM و b: NL. يظهر الإدراج الأيمن النوى السمعية التي لوحظت في التكبير الموضوعي 60x والمحور الطوبولوجي المنحني من LF إلى HF على طول محور مذنب جانبي إلى روسترال إنسي. الاختصارات: NM = النواة المغنوسليلية; NL = نواة الصفيحة. LF = الخلايا العصبية منخفضة التردد نسبيا; HF = الخلايا العصبية عالية التردد; L = جانبي; R = الروستروال. C = الذيلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: المقاطع التسلسلية التمثيلية الأفقية / المستعرضة الحادة الزاوية (45 درجة) (A-C) اليسار: الأقسام التسلسلية لجذع الدماغ ، النوى السمعية المميزة في دائرة متقطعة بيضاء. الإدراج الأوسط هو منظر أكبر للمنطقة السمعية. (أ) يظهر الإدراج الأوسط أكبر انتشار للخلايا العصبية NM و NL في هذه الشرائح. (ب، ج) الإدراج الأوسط: تظهر النوى السمعية المميزة بخطوط بيضاء متقطعة تغيرا طوبولوجيا تدريجيا عند مقارنتها ب (A-C). على اليمين: إدراج القمر الصناعي الذي يظهر النوى السمعية a: NM و b: NL في تكبير الهدف 60x. يدور المحور التونوتوبي من مناطق LF إلى HF في NM و NL بشكل زاوي من الشرائح الجانبية إلى الشرائح الإنسية. الاختصارات: NM = النواة المغنوسليلية; NL = نواة الصفيحة. LF = الخلايا العصبية منخفضة التردد نسبيا; HF = الخلايا العصبية عالية التردد; V = البطني; R = الروستروال. D = الظهرية. C = الذيلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي S1: فرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب عن حقن التيار الجسدي. خصائص الاستجابة من الخلايا العصبية منخفضة التردد وعالية التردد إلى حقن التيار الجسدي 100 مللي ثانية في وضع المشبك الحالي. تم اختيار الخلايا العصبية من نفس شريحة جذع الدماغ السهمي. تتراوح الحقن من -100 إلى +200 pA بخطوات من زيادات +10 pA ، ومدة زمنية 100 مللي ثانية. وينظر إلى إمكانات العمل استجابة للخطوات الحالية الكافية لإزالة الاستقطاب. يتوافق الفيديو مع الآثار النهائية الموضحة في الشكل 3C. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
فيديو تكميلي S2: فرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب حقن التيار الجسدي. على غرار الفيديو التكميلي S1 ، يعرض هذا الفيديو خصائص الاستجابة من خلية عصبية منخفضة التردد وعالية التردد إلى حقن التيار الجسدي 100 مللي ثانية في وضع المشبك الحالي. تم اختيار الخلايا العصبية من نفس شريحة جذع الدماغ السهمي. تتراوح الحقن من -100 إلى +200 pA بخطوات من زيادات +10 pA ، ومدة زمنية 100 مللي ثانية. وينظر إلى إمكانات العمل استجابة للخطوات الحالية الكافية لإزالة الاستقطاب. يتوافق الفيديو مع الآثار النهائية الموضحة في الشكل 3D. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
سمحت الأقسام الإكليلية من أنسجة جذع الدماغ الجنينية الدجاج بدراسة الصفيحة الفردية ذات التردد المتساوي لعقود1،2،5. ومع ذلك ، فإن تنظيم tonotopic (أي التردد) لجذع الدماغ السمعي الدجاج معقد طوبولوجيا وقد يكون أكثر سهولة في المحاور التشريحية الأخرى اعتمادا على سؤال البحث المحدد. على الرغم من أنها كافية للتحقيق في الأسئلة التشريحية والفسيولوجية المتعلقة بمناطق التردد المتساووي الفردية ، إلا أن دراسة الاختلافات التونومية وتطورها عبر مناطق جذع الدماغ السمعية الأكبر محدودة إلى حد ما بالأقسام الإكليلية. للتغلب على هذا القيد ، يصف هذا البروتوكول النهج في المستويات السهمية والأفقية والأفقية / العرضية لتقديم أمثلة إضافية على أنسجة جذع الدماغ السمعية التي تظهر أقصى خصائص التوتر والتدرجات في قسم جذع الدماغ الفردي.
تظهر أقسام القوس في مناطق جذع الدماغ السمعية أن مناطق التوتر المختلفة موزعة عبر منطقة أكبر داخل الشريحة مقارنة بالأقسام الإكليلية (المنطقة السمعية السهمية = ~ 300-600 ميكرومتر ، المنطقة السمعية الإكليلية = ~ 200-350 ميكرومتر). على سبيل المثال ، تم تصور مناطق NM و NL على مساحة أكبر على طول المحور الوردي الذيلي في أقسام سهمية (على سبيل المثال ، الشكل 2B) ، وتم احتواء التدرج الوظيفي التونوتوبي الذي يمتد على طول هذا المحور التشريحي إلى حد كبير داخل شريحة سهمية واحدة. وقد تأكد ذلك أيضا من خلال تسجيلات المشبك الحالي للاختلافات العصبية الجوهرية التي تختلف على طول التدرج الذيلي للسطح كما تم الإبلاغ عنه سابقا14,15 (على سبيل المثال ، الشكل 3C ، D). يمكن للتجارب المستقبلية التي تسلط الضوء على الخصائص التشريحية والكيميائية النسيجية المناعية على طول المحور التونوتوبي أن تحقق بشكل أكبر في التدرجات المعروفة للخصائص السمعية داخل مستوى شريحة سهمية واحدة. وتشمل هذه ، على سبيل المثال لا الحصر ، أنماط التعبير عن قناة MAP2 وقناة البوتاسيوم ، والتي هي تدرجات معروفة للهندسة التغصنية والخصائص الجوهرية ل NM و NL التي تم عرضها سابقا في الأقسام الإكليليةالمتعاقبة 16.
تظهر الأقسام الأفقية لمناطق جذع الدماغ السمعية أن NM و NL يقعان باتجاه خط الوسط. يعمل جزء من الألياف المحورية السمعية قطريا أو عموديا على المستوى الأفقي (الشكل 4). يمكن أن تتبع هذه الألياف عن طريق صنع شريحة زاوية حادة 45 درجة إلى المستوى السهمي. كانت الشرائح الأفقية / المستعرضة الناتجة أكبر من الشرائح السهمية أو الأفقية ، وكانت الألياف المحورية الطويلة تمر عبر المحور الوردي الذيلي لكل من الجانبين الجانبي والمعاكس. يمكن تصور كل من NM و NL في منطقة قطرية أكبر (~ 400-700 ميكرومتر) بحيث يمكن تصور الاتصالات المعاكسة على طول محور جانبي إنسي. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح مستوى الشريحة الأفقي / العرضي أيضا كيف أن المناطق السمعية والتدرج التونوتوبي الناتج يصنعان منعطفا زاويا (الشكل 5). إن التعرض الزاوي للوصلات المتعارضة في مساحة أكبر يجعل هذه الشرائح أكثر ملاءمة للتحفيز الكهروفسيولوجي ودراسات الدوائر الدقيقة من الشرائح الإكليلية التقليدية.
مزايا إضافية
يتطلب تكوين الدوائر الدقيقة السمعية تنسيقا زمنيا مكانيا للإشارات التي تعزز بقاء الخلايا العصبية ، وتكوين التشابك العصبي ، والتمايز المحوري ، والعمارة الشجيرية ، والنضج. وبالتالي ، يمكن استخدام أقسام جذع دماغ بديلة من الدائرة السمعية الدقيقة لجنين الدجاج لمواضيع البحث التالية: التنظيم المورفولوجي للخلايا العصبية في أبعاد مختلفة طبوغرافيا. تنظيم ورسم خرائط الشبكات العصبية لجميع النوى السمعية والدهليزية ؛ تحديد وتوصيف أنماط نشاط مكونات الدائرة في مستويات التردد المتساوي والتونوبوتي؛ التنظيم الطبوغرافي للدوائر الدقيقة المثيرة مقابل المثبطة والعلاقات مع مجموعات الخلايا العصبية المتخصصة (النوى) ؛ الموقع المكاني للخلايا العصبية النووية السمعية و CF17 التنبؤي ؛ الاستهداف المنهجي لأنواع محددة من الخلايا العصبية التونوتوبية ؛ تتبع الخلايا السلفية وتطورها إلى نوى محفوظة ؛ النسب الوراثي للخلايا إلى تطور الدوائر العصبية18 ؛ تشريح جذع الدماغ المقارن بين الأنواع ؛ التحقيق في الدوائر الدهليزية مثل مجمع ديتر الدهليزي (DC)19 ؛ والتزامن والحديث المتبادل بين النوى الدهليزية.
قد يساعد النهج متعدد الأوجه باستخدام مستويات شرائح مختلفة في الإجابة على الأسئلة الأساسية حول الخصائص التشريحية والفيزيائية الحيوية غير المعروفة للدوائر الدقيقة لجذع الدماغ. ومن الأمثلة الجيدة على ذلك العلاقة بين النوى السمعية الرئيسية (NM ، NA ، NL ، و SON) والنوى الدهليزية ، بما في ذلك النواة الظهرية لل lemniscus الجانبية (LLDp) ، والنواة شبه القمرية (SLu)20 ، والنواة العرضية (TN)3. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول وهذه الدراسات القائمة على الشرائح لها بعض القيود.
الاحتياطات والقيود
اعتمادا على المؤسسة التي تجري التجارب ، قد تختلف المبادئ التوجيهية الأخلاقية والتعامل مع أجنة الدجاج. في حين أن المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر تسمح بقطع الرأس السريع ، هناك طرق بديلة للقتل الرحيم لجنين الدجاج21. أنسجة جذع دماغ جنين الدجاج النامية في وقت مبكر ناعمة وحساسة مقارنة بالأجنة الأكبر سنا. لديها العديد من الاتصالات والأوعية الدموية على السطح التي تحتاج إلى مزيد من الحذر عند إزالتها. يجب الاحتفاظ بالأنسجة في dACSF البارد ودمجها مع 95٪ O 2/5٪ CO2 لزيادة قابلية البقاء.
طريقة التقطيع السهمي مفيدة فقط للتونوتوبي الجانبي. توفر طريقة التقطيع هذه شرائح أكبر من الشرائح الإكليلية ، والتي قد يكون التعامل معها محفوفا بالمخاطر. ومع ذلك ، يمكن للمرء تقليم الشرائح باستخدام طرق الإبرة المتقاطعة الموضحة بالتفصيل في مكان آخر22. يمكن أن يؤدي استخدام 4٪ من كتلة الأغاروز LMP المدمجة في جذع الدماغ إلى إنقاذ الهياكل الحساسة في الشرائح ، ولكن يجب توخي الحذر لعدم صب الأغاروز الساخن بشكل مفرط. إن ضبطه بسرعة عن طريق وضع جذع الدماغ المسدود بالأغاروز في بيئة مبردة لمدة 1 دقيقة تقريبا يجعل الشرائح أكثر قابلية للتطبيق للتسجيلات الكهروفسيولوجية.
تطبيق الغراء الفائق بكميات زائدة يمكن أن يكون ساما. يجب تطبيقه بالحد الأدنى ، ويجب غسل الكميات الفائضة على الفور عن طريق تغيير dACSF. بالنسبة للشرائح الزاوية الحادة (45 درجة) ، يعد قطع زاوية كتلة الأغاروز أمرا بالغ الأهمية ؛ يمكن للمرء استخدام مرآة لرؤية الزاوية الأمامية أثناء قطع كتلة الأغاروز بشفرة حادة. قد تحتوي الشفرات المتاحة تجاريا على طبقة شمعية يجب مسحها بالكحول وتجفيفها قبل الاستخدام. مطلوب التحسين لسرعة القطع الاهتزازي وتردده لأن خصلات الألياف المحورية أصعب من الأنسجة القشرية أو المصفوفة. الحفاظ على سعة عالية واستخدام محلول تشريح مبرد قد يمنع تلف الأنسجة.
يجب تحضير جميع المحاليل طازجة ، ويجب إضافة Ca2 + و Mg2+ إلى ACSF بعد فقاعات 95٪ O 2/5٪ CO2 . خلاف ذلك ، قد يكون هناك هطول الأمطار من Ca2 +. يجب استخدام فرشاة الطلاء للتعامل مع الشرائح بلطف داخل الاهتزاز. حافظ على إجمالي وقت التقطيع أقل من 15 دقيقة إن أمكن. يمكن استخدام ماصة باستور الزجاجية للمناورة بشرائح جذع الدماغ.
لا تستخدم عوامل الغسيل المنظفة أو المسببة للتآكل للأواني الزجاجية والمعدات التي تلامس الشرائح المستخدمة في الفيزيولوجيا الكهربية. تمثل الصور الملتقطة مظهر أنسجة سميكة 200-300 ميكرومتر تحت بصريات تباين التداخل التفاضلي (DIC). ستكون الجودة البصرية أسوأ من الكيمياء النسيجية المناعية أو المجهر الإلكتروني ، ولكنها تعكس بدقة ما سيراه المجرب عند إجراء التسجيلات الكهروفسيولوجية.
الدراسات المتعلقة بالتطور المبكر للدوائر الدقيقة على طول محور تشريحي بديل ، سواء كانت ظهرية بطنية ، أو ذيلية ، أو متناقضة ، محدودة في جذع الدماغ السمعي الدجاج. أحد أسباب ذلك هو أن دور الرموز النسخية وتنظيم التطور التونوتوبي في جذع الدماغ لا يزال غير مفهوم تماما. غالبا ما تضيع الظواهر الوظيفية مثل التشكيل من أعلى إلى أسفل والنشاط التلقائي عند مراقبة النشاط في المختبر. ومع ذلك ، يتم استكمال البحث في الجسم الحي بتسجيلات عصبية واحدة محددة ومباشرة ممكنة فقط في ظروف الشريحة هذه. يمكن أن يوفر صقل الحصول على أنسجة جذع الدماغ على طول اتجاهات مختلفة معلومات ثاقبة حول تطور وتعقيد التدرجات التونوتوبية في الدوائر الدقيقة لجذع الدماغ السمعي للدجاج.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أن البحث قد تم إجراؤه دون أي مصلحة تجارية أو مالية وأنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NIDCD R01 DC017167. نشكر كريستين ماكليلان على تقديم تعليقات تحريرية على نسخة سابقة من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
| Anti-vibration table 30"x 36" - OTMC - 63533 | TMC | ||
| Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
| Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
| Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
| DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
| Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
| Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
| Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
| Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
| pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
| pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
| Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
| Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
| Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
| Chemicals- list | |||
| Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
| CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
| Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
| Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
| Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
| KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
| NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
| NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |
References
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., et al. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).
- Shao, M., et al. Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period. Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).
- Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).
- Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. Journal of Visualized Experiments. (49), e2527 (2011).
- Sanchez, J. T., Lu, Y. Glutamate signaling in the auditory brainstem. Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. 64 (4), Springer. New York, NY. 75-108 (2017).
- Parks, T. N. Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study. Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Köppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).
- Fukui, I., et al. Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).
- Wang, X., et al. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- Hong, H., Sanchez, J. T. Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system. Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).
- Hong, H., et al. Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).
- Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis. eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).
- Tabor, K. M., et al. Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).
- Lipovsek, M., Wingate, R. J. Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei. Elife. 7, 40232 (2018).
- Passetto, M. F., et al. Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter's vestibular complex of the chick brain. Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).
- Curry, R. J., Lu, Y. Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons. Brain Research. 1752, 147258 (2021).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).
