Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla icke-koronala auditiva hjärnstamskivor av kycklingembryot för undersökning av tonotopiska egenskaper och utvecklingsbanor inom en hjärnstamsskiva. Dessa skivor inkluderar sagittala, horisontella och horisontella / tvärgående sektioner som omfattar större tonotopiska regioner inom ett enskilt skivplan som de traditionella koronala sektionerna.
Kycklingembryot är en allmänt accepterad djurmodell för att studera den auditiva hjärnstammen, bestående av högspecialiserad mikrokrets och neuronal topologi differentiellt orienterad längs en tonotopisk (dvs frekvens) axel. Den tonotopiska axeln tillåter segregerad kodning av högfrekventa ljud i det rostral-mediala planet och lågfrekvent kodning i caudo-laterala regioner. Traditionellt tillåter koronala hjärnstamskivor av embryonal vävnad studier av relativ individuell iso-frekvenslamina. Även om det är tillräckligt för att undersöka anatomiska och fysiologiska frågor som rör enskilda isofrekvensregioner, är studien av tonotopisk variation och dess utveckling över större auditiva hjärnstamsområden något begränsad. Detta protokoll rapporterar hjärnstamsskivningstekniker från kycklingembryon som omfattar större gradienter av frekvensregioner i den nedre auditiva hjärnstammen. Användningen av olika skivningsmetoder för kyckling auditiv hjärnstamsvävnad tillåter elektrofysiologiska och anatomiska experiment inom en hjärnstamsskiva, där större gradienter av tonotopiska egenskaper och utvecklingsbanor är bättre bevarade än koronasektioner. Flera skivningstekniker möjliggör förbättrad undersökning av de olika anatomiska, biofysiska och tonotopiska egenskaperna hos auditiva hjärnstamsmikrokretsar.
Kycklingembryot är en värdefull forskningsmodell för att studera grundläggande biologiska frågor inom många och olika vetenskapliga områden inklusive cellbiologi, immunologi, patologi och utvecklingsneurobiologi. Mikrokretsen i kycklingens auditiva hjärnstam är ett utmärkt exempel på en högspecialiserad krets som kan förstås när det gäller hörselmorfologi och fysiologi. Till exempel beskrev Rubel and Parks (1975) först den tonotopiska orienteringen (dvs frekvensgradienten) hos kycklingkärnan magnocellularis (NM) och nucleus laminaris (NL) som en linjär funktion över kärnans axel, orienterad ~ 30 ° med avseende på sagittalplanet. Enskilda neuroner i NM och NL kodar för sin bästa ljudfrekvens – känd som deras karakteristiska frekvens (CF) – längs det rostral-mediala planet till caudo-laterala regionen. Högfrekventa känsliga neuroner ligger i den rostral-mediala regionen och lågfrekvent-känsliga neuroner är belägna caudo-lateralt. Som sådan har traditionella dissektionsmetoder för auditiv hjärnstamsvävnad för att studera tonotopiska egenskaper använt successiva koronala skivor. Faktum är att auditiva mikrokretsar för att utveckla kycklingembryon har etablerats som ett modellsystem för att studera signalbehandling av tonotopiska hörselfunktioner genom successiva kaudala till rostrala koronaplana hjärnstamskivor i årtionden 1,2,3,4,5,6.
Den tonotopiska organisationen av NM och NL är emellertid topologiskt och morfologiskt invecklad. Hörselnervens ingångar fördelas så att höga CF-ingångar slutar i endbulbliknande strukturer som täcker minst en fjärdedel av en adendritisk NM-cells somatiska omkrets. Omvänt är låga CF-ingångar inte organiserade med ändlampaliknande terminaler utan med flera boutonsynapser på dendriter av NM-neuroner. Mellersta CF-ingångar avslutas som både ändlampa och boutonliknande synapser 4,7,8,9,10,11,12. I NL är den mycket stereotypa dendritiska gradienten uppenbar inte bara i dendritisk längd utan också i dendritisk bredd. Denna unika dendritiska gradient överensstämmer nära den tonotopiska axeln. Dendriterna genomgår en 11-faldig ökning i längd och femfaldig ökning av bredden från hög- till låg-CF-neuroner, respektive6. För att övervinna sådana invecklade fördelningar av dessa kärnor i koronala skivor beskriver detta protokoll dissektionsmetoder i sagittala, horisontella och horisontella / tvärgående plan. Dessa skivningstekniker ger exempel på auditiv hjärnstamsvävnad som uppvisar maximala tonotopiska egenskaper i ett enskilt skivplan.
Koronala sektioner av kycklingembryonal hjärnstamsvävnad har möjliggjort studier av relativ individuell iso-frekvens lamina i årtionden 1,2,5. Den tonotopiska (dvs frekvens) organisationen av kycklingens auditiva hjärnstam är emellertid topologiskt invecklad och kan vara mer tillgänglig i andra anatomiska axlar beroende på den specifika forskningsfrågan. Även om det är tillräckligt för att undersöka anatomiska och fysiologiska frågor som rör enskilda isofrekvensregioner, är studien av tonotopiska variationer och dess utveckling över större auditiva hjärnstamsområden något begränsad av koronala sektioner. För att övervinna denna begränsning beskriver detta protokoll tillvägagångssätt i sagittala, horisontella och horisontella / tvärgående plan för att ge ytterligare exempel på auditiv hjärnstamsvävnad som uppvisar maximala tonotopiska egenskaper och gradienter i en enskild hjärnstamsektion.
Sagittala sektioner av auditiva hjärnstamsregioner visar att olika tonotopiska områden är fördelade över en större region inom skivan jämfört med koronala sektioner (sagittal hörselarea = ~ 300-600 μm, koronal hörselarea = ~ 200-350 μm). Till exempel visualiserades NM- och NL-regioner över ett större område längs den rostro-kaudala axeln i sagittala sektioner (t.ex. figur 2B), och den funktionella tonotopiska gradienten som löper längs denna anatomiska axel fanns till stor del i en enda sagittal skiva. Detta bekräftades ytterligare med strömkläminspelningar av inneboende neuronala skillnader som varierar längs den rostral-kaudala gradienten som tidigare rapporterats14,15 (t.ex . figur 3C,D). Framtida experiment som belyser anatomiska och immunohistokemiska egenskaper längs den tonotopiska axeln kan ytterligare undersöka kända gradienter av hörselegenskaper inom ett enda sagittalt skivplan. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, MAP2-färgning och kaliumkanaluttrycksmönster, som är kända gradienter av dendritisk arkitektur och inneboende egenskaper hos NM och NL som tidigare har visats i på varandra följande koronala avsnitt16.
Horisontella sektioner av auditiva hjärnstamsregioner visar att NM och NL ligger mot mittlinjen. En del av de auditiva axonala fibrerna löper diagonalt eller vinkelrätt mot horisontalplanet (figur 4). Dessa fibrer kan följas genom att göra en akut vinkelskiva 45° till sagittalplanet. De resulterande horisontella / tvärgående skivorna var större än sagittala eller horisontella skivor, och långa axonala fibrer gick genom den rostro-kaudala axeln för både ipsilaterala och kontralaterala sidor. Både NM och NL kan visualiseras i ett större diagonalt område (~ 400-700 μm) så att kontralaterala anslutningar kan visualiseras längs en lateral-medial axel. Dessutom visar det horisontella/tvärgående segmentplanet också hur hörselområdena och den resulterande tonotopiska gradienten gör en vinkelsväng (figur 5). Vinkelexponering av kontralaterala anslutningar i ett större område gör dessa skivor mer lämpade för elektrofysiologisk stimulering och mikrokretsstudier än traditionella koronalskivor.
Ytterligare fördelar
Bildandet av auditiva mikrokretsar kräver spatiotemporal samordning av ledtrådar som främjar neuronal överlevnad, synaptogenes, axonal differentiering, dendritisk arkitektur och mognad. Således kan en alternativ hjärnstamsektion av kycklingembryots auditiva mikrokrets användas för följande forskningsämnen: morfologisk organisation av neuroner i topografiskt olika dimensioner; organisera och kartlägga connectomes av alla auditiva och vestibulära kärnor; Identifiering och karakterisering av kretsbeståndsdelarnas aktivitetsmönster i ISO-frekvens- och tonotopiska plan. den topografiska organisationen av excitatoriska kontra hämmande mikrokretsar och relationer till specialiserade neuronpopulationer (kärnor); rumslig placering av hörselkärnor neuroner och dess prediktiva CF17; systematisk inriktning av specifika tonotopiska neuronala typer; spåra stamceller och deras utveckling till konserverade kärnor; genetisk härstamning av celler till utvecklingen av neuronala kretsar18; jämförande hjärnstamsanatomi mellan arter; undersökning av vestibulära kretsar som Deiters vestibulära komplex (DC)19; och synkronisering och korsprat mellan vestibulära kärnor.
Ett mångfacetterat tillvägagångssätt med olika skivplan kan hjälpa till att svara på grundläggande frågor om okända anatomiska och biofysiska egenskaper hos hjärnstamsmikrokretsar. Ett bra exempel är förhållandet mellan stora hörselkärnor (NM, NA, NL och SON) och de vestibulära kärnorna, inklusive dorsalkärnan i lateral lemniscus (LLDp), semilunarkärnan (SLu)20 och den tangentiella kärnan (TN)3. Detta protokoll och dessa skivbaserade studier har dock vissa begränsningar.
Försiktighetsåtgärder och begränsningar
Beroende på vilken institution som utför experimenten kan etiska riktlinjer och hanteringen av kycklingembryon skilja sig åt. Medan National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals tillåter snabb halshuggning, finns det alternativa metoder för dödshjälp av kycklingembryon21. Tidigt utvecklande kycklingembryo hjärnstamsvävnad är mjuk och känslig jämfört med äldre embryon. Den har flera anslutningar och blodkärl på ytan som behöver extra försiktighet när du tar bort dem. Vävnad bör förvaras i iskall dACSF och perfuseras med 95% O2/5%CO2 för att öka livskraften.
Sagittal skivningsmetoden är endast användbar för ipsilateral tonotopi. Denna skivningsmetod ger större skivor än koronaskivor, vars hantering kan vara osäker. Man kan dock trimma skivorna med hjälp av korsnålsmetoder som beskrivs i detalj någon annanstans22. Att använda 4% LMP agarosblock inbäddad hjärnstam kan spara känsliga strukturer i skivor, men man måste vara försiktig så att man inte häller alltför varm agaros. Att ställa in det snabbt genom att placera den agarosblockerade hjärnstammen i en kyld miljö i ~ 1 min gör skivorna mer livskraftiga för elektrofysiologiska inspelningar.
Applicering av superlim i överskott kan vara giftigt. Det måste appliceras minimalt, och överskottsmängder bör tvättas omedelbart genom att byta ut dACSF. För akuta vinkelskivor (45 °) är skärning av vinkeln på agarosblocket avgörande; Man kan använda en spegel för att se den främre vinkeln medan man skär Agaros-blocket med ett skarpt blad. Kommersiellt tillgängliga blad kan ha en vaxbeläggning som ska torkas av med alkohol och torkas före användning. Optimering krävs för vibratomskärningshastigheten och frekvensen eftersom axonala fibertufts är hårdare än kortikal eller matrisvävnad. Att hålla en hög amplitud och använda kyld dissektionslösning kan förhindra vävnadsskador.
Alla lösningar ska beredas färska och Ca 2+ och Mg2+ ska tillsättas ACSF efter bubblande 95%O 2/5%CO2. Annars kan det bli nederbörd på Ca2+. En pensel ska användas för att hantera skivorna försiktigt i vibratomet. Håll den totala skivtiden under 15 min om möjligt. En pasteurpipett i glas kan användas för att manövrera hjärnstamskivor.
Använd inte tvättmedel eller frätande tvättmedel för glas och utrustning som kommer i kontakt med skivorna som används i elektrofysiologi. Bilderna som tagits representerar utseendet på 200-300 μM tjock vävnad under differentiell interferenskontrast (DIC) optik. Den visuella kvaliteten kommer att vara sämre än immunhistokemi eller elektronmikroskopi, men den återspeglar exakt vad en experimenter kommer att se när man utför elektrofysiologiska inspelningar.
Studier som hänför sig till den tidiga utvecklingen av mikrokretsar längs en alternativ anatomisk axel, oavsett om de är dorsal-ventrala, rostral-kaudala eller ipsilaterala-kontralaterala, är begränsade i kycklingens auditiva hjärnstam. En anledning till detta är att transkriptionella koders roll och reglering av tonotopisk utveckling i hjärnstammen fortfarande inte är helt förstådd. Funktionella fenomen som top-down-modulering och spontan aktivitet går ofta förlorade när man observerar aktivitet in vitro. In vivo-forskning kompletteras dock med specifika och direkta enskilda neuroninspelningar endast möjliga under dessa skivförhållanden. Förfining av att erhålla hjärnstamsvävnad längs olika orienteringar kan ge insiktsfull information om utvecklingen och komplexiteten hos tonotopiska gradienter i kycklingens auditiva hjärnstamsmikrokretsar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH/NIDCD R01 DC017167-bidraget. Vi tackar Kristine McLellan för att hon gav redaktionella kommentarer till en tidigare version av manuskriptet.
Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
Anti-vibration table 30"x 36" – OTMC – 63533 | TMC | ||
Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
Chemicals- list | |||
Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |