यहां हम एक ब्रेनस्टेम स्लाइस के भीतर टोनोटोपिक गुणों और विकासात्मक प्रक्षेपवक्रों की जांच के लिए चिकन भ्रूण के गैर-कोरोनल श्रवण ब्रेनस्टेम स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन स्लाइसों में धनु, क्षैतिज और क्षैतिज / अनुप्रस्थ अनुभाग शामिल हैं जो एक व्यक्तिगत स्लाइस प्लेन के भीतर बड़े टोनोटोपिक क्षेत्रों को शामिल करते हैं जो पारंपरिक कोरोनल अनुभाग हैं।
चिकन भ्रूण श्रवण ब्रेनस्टेम का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकृत पशु मॉडल है, जो अत्यधिक विशिष्ट माइक्रोसर्किटरी और न्यूरोनल टोपोलॉजी से बना है जो टोनोटोपिक (यानी, आवृत्ति) अक्ष के साथ अलग-अलग उन्मुख है। टोनोटोपिक अक्ष रोस्ट्रल-औसत दर्जे का विमान में उच्च आवृत्ति ध्वनियों के अलग-अलग एन्कोडिंग और कॉडो-पार्श्व क्षेत्रों में कम आवृत्ति एन्कोडिंग की अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, भ्रूण के ऊतकों के कोरोनल ब्रेनस्टेम स्लाइस सापेक्ष व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति लैमिना के अध्ययन की अनुमति देते हैं। यद्यपि व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति क्षेत्रों से संबंधित शारीरिक और शारीरिक प्रश्नों की जांच करने के लिए पर्याप्त है, टोनोटोपिक भिन्नता का अध्ययन और बड़े श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों में इसका विकास कुछ हद तक सीमित है। यह प्रोटोकॉल चिकन भ्रूण से ब्रेनस्टेम स्लाइसिंग तकनीकों की रिपोर्ट करता है जिसमें निचले श्रवण ब्रेनस्टेम में आवृत्ति क्षेत्रों के बड़े ग्रेडिएंट शामिल हैं। चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के लिए विभिन्न टुकड़ा करने की क्रिया विधियों का उपयोग एक ब्रेनस्टेम स्लाइस के भीतर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और शारीरिक प्रयोगों की अनुमति देता है, जहां टोनोटोपिक गुणों और विकासात्मक प्रक्षेपवक्रों के बड़े ढाल को कोरोनल वर्गों की तुलना में बेहतर संरक्षित होते हैं। कई टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक श्रवण ब्रेनस्टेम माइक्रोसर्किट के विविध शारीरिक, बायोफिजिकल और टोनोटोपिक गुणों की बेहतर जांच की अनुमति देती है।
चिकन भ्रूण कोशिका जीव विज्ञान, इम्यूनोलॉजी, पैथोलॉजी और विकासात्मक तंत्रिका जीव विज्ञान सहित कई और विविध वैज्ञानिक क्षेत्रों में बुनियादी जैविक प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान शोध मॉडल है। चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम की माइक्रोसर्किटरी एक अत्यधिक विशिष्ट सर्किट का एक उत्कृष्ट उदाहरण है जिसे श्रवण आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान के संदर्भ में समझा जा सकता है। उदाहरण के लिए, रूबेल और पार्क (1975) ने पहली बार चिकन न्यूक्लियस मैग्नोसेल्युलरिस (एनएम) और न्यूक्लियस लैमिनारिस (एनएल) के टोनोटोपिक ओरिएंटेशन (यानी, आवृत्ति ढाल) को नाभिक की धुरी पर एक रैखिक कार्य के रूप में वर्णित किया, धनु विमान के संबंध में ~ 30 ° उन्मुख। एनएम और एनएल में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स अपनी सबसे अच्छी ध्वनि आवृत्ति को एन्कोड करते हैं- जिसे उनकी विशेषता आवृत्ति (सीएफ) के रूप में जाना जाता है – कॉडो-पार्श्व क्षेत्र में रोस्ट्रल-औसत दर्जे का विमान के साथ। उच्च आवृत्ति-संवेदनशील न्यूरॉन्स रोस्ट्रल-औसत दर्जे का क्षेत्र में होते हैं और कम आवृत्ति-संवेदनशील न्यूरॉन्स कौडो-पार्श्व रूप से स्थित होते हैं। इस प्रकार, टोनोटोपिक गुणों का अध्ययन करने के लिए श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के पारंपरिक विच्छेदन विधियों ने क्रमिक कोरोनल स्लाइस का उपयोग किया है। दरअसल, चिकन भ्रूण के विकास के श्रवण माइक्रोसर्किट को दशकों 1,2,3,4,5,6 के लिए क्रमिक पुच्छल-टू-रोस्ट्रल कोरोनल प्लेन ब्रेनस्टेम स्लाइस के माध्यम से टोनोटोपिक श्रवण कार्यों के सिग्नल प्रोसेसिंग का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया है।
हालांकि, एनएम और एनएल का टोनोटोपिक संगठन टोपोलॉजिकल और रूपात्मक रूप से जटिल है। श्रवण तंत्रिका इनपुट इस तरह वितरित किए जाते हैं कि उच्च सीएफ इनपुट एंडबल्ब जैसी संरचनाओं में समाप्त होते हैं जो एक एडेंड्रिटिक एनएम सेल की दैहिक परिधि के कम से कम एक-चौथाई को कवर करते हैं। इसके विपरीत, कम सीएफ इनपुट अंत बल्ब जैसे टर्मिनलों के साथ व्यवस्थित नहीं होते हैं, लेकिन एनएम न्यूरॉन्स के डेंड्राइट्स पर कई बाउटन सिनैप्स के साथ। मध्य सीएफ इनपुट समाप्त होते हैं क्योंकि अंत बल्ब और बाउटन जैसे सिनैप्स दोनों 4,7,8,9,10,11,12 होते हैं। एनएल में, अत्यधिक रूढ़िवादी डेंड्राइटिक ढाल न केवल डेंड्राइटिक लंबाई में बल्कि डेंड्राइटिक चौड़ाई में भी स्पष्ट है। यह अद्वितीय डेंड्राइटिक ढाल टोनोटोपिक अक्ष के अनुरूप है। डेंड्राइट्स क्रमशः उच्च से निम्न सीएफ न्यूरॉन्स से लंबाई में 11 गुना वृद्धि और चौड़ाई में पांच गुना वृद्धि से गुजरते हैं। कोरोनल स्लाइस में इन नाभिक के ऐसे जटिल वितरण को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल धनु, क्षैतिज और क्षैतिज / अनुप्रस्थ विमानों में विच्छेदन दृष्टिकोण का वर्णन करता है। ये टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के उदाहरण प्रदान करती है जो एक व्यक्तिगत स्लाइस विमान में अधिकतम टोनोटोपिक गुणों का प्रदर्शन करती है।
चिकन भ्रूण ब्रेनस्टेम ऊतक के कोरोनल वर्गों ने दशकों 1,2,5 के लिए सापेक्ष व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति लैमिना के अध्ययन की अनुमति दी है। हालांकि, चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम का टोनोटोपिक (यानी, आवृत्ति) संगठन टोपोलॉजिकल रूप से जटिल है और विशिष्ट शोध प्रश्न के आधार पर अन्य शारीरिक कुल्हाड़ियों में अधिक सुलभ हो सकता है। यद्यपि व्यक्तिगत आईएसओ-आवृत्ति क्षेत्रों से संबंधित शारीरिक और शारीरिक प्रश्नों की जांच करने के लिए पर्याप्त है, टोनोटोपिक विविधताओं का अध्ययन और बड़े श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों में इसका विकास कोरोनल वर्गों द्वारा कुछ हद तक सीमित है। इस सीमा को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक व्यक्तिगत ब्रेनस्टेम अनुभाग में अधिकतम टोनोटोपिक गुणों और ढाल प्रदर्शित करने वाले श्रवण ब्रेनस्टेम ऊतक के अतिरिक्त उदाहरण प्रदान करने के लिए धनु, क्षैतिज और क्षैतिज /
श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों के धनु वर्गों से पता चलता है कि विभिन्न टोनोटोपिक क्षेत्रों को कोरोनल वर्गों (धनु श्रवण क्षेत्र = ~ 300-600 μm, कोरोनल श्रवण क्षेत्र = ~ 200-350 μm) की तुलना में टुकड़े के भीतर एक बड़े क्षेत्र में वितरित किया जाता है। उदाहरण के लिए, एनएम और एनएल क्षेत्रों को धनु वर्गों (जैसे, चित्रा 2 बी) में रोस्ट्रो-पुच्छल अक्ष के साथ एक बड़े क्षेत्र पर कल्पना की गई थी, और इस शारीरिक अक्ष के साथ चलने वाले कार्यात्मक टोनोटोपिक ढाल काफी हद तक एक एकल धनु टुकड़े के भीतर निहित थे। यह आंतरिक न्यूरोनल मतभेदों की वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ पुष्टि की गई थी जो रोस्ट्रल-पुच्छल ढाल के साथ भिन्न होती है जैसा कि पहले14,15 (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 सी, डी) की सूचना दी गई थी। भविष्य के प्रयोग जो टोनोटोपिक अक्ष के साथ शारीरिक और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल गुणों को उजागर करते हैं, एक एकल धनु टुकड़ा विमान के भीतर श्रवण गुणों के ज्ञात ढाल की जांच कर सकते हैं। इनमें एमएपी 2 धुंधला और पोटेशियम चैनल अभिव्यक्ति पैटर्न शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं, जो डेंड्राइटिक आर्किटेक्चर और एनएम और एनएल के आंतरिक गुणों के ज्ञात ग्रेडिएंट हैं जो पहले क्रमिक कोरोनल सेक्शन16 में दिखाए गए हैं।
श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों के क्षैतिज वर्गों से पता चलता है कि एनएम और एनएल मध्य रेखा की ओर स्थित हैं। श्रवण अक्षीय तंतुओं का एक हिस्सा क्षैतिज विमान (चित्रा 4) के तिरछे या लंबवत चलता है। इन तंतुओं को धनु विमान के लिए 45 ° एक तीव्र कोणीय टुकड़ा बनाकर पीछा किया जा सकता है। अनुप्रस्थ स्लाइस धनु या क्षैतिज स्लाइस से बड़े थे, और लंबे अक्षीय फाइबर इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल दोनों पक्षों के लिए रोस्ट्रो-पुच्छल अक्ष के माध्यम से पाठ्यक्रम करते थे। एनएम और एनएल दोनों को एक बड़े विकर्ण क्षेत्र (~ 400-700 μm) में देखा जा सकता है जैसे कि पार्श्व-औसत दर्जे का अक्ष के साथ कॉन्ट्रालेटरल कनेक्शन की कल्पना की जा सकती है। अनुप्रस्थ टुकड़ा विमान यह भी दिखाता है कि श्रवण क्षेत्र और परिणामस्वरूप टोनोटोपिक ढाल एक कोणीय मोड़ (चित्रा 5) कैसे बनाते हैं। एक बड़े क्षेत्र में कॉन्ट्रालेटरल कनेक्शन का कोणीय एक्सपोजर इन स्लाइसों को पारंपरिक कोरोनल स्लाइस की तुलना में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उत्तेजना और माइक्रोसर्किटरी अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त बनाता है।
अतिरिक्त फायदे
श्रवण माइक्रोसर्किट के गठन के लिए संकेतों के स्थानिक समन्वय की आवश्यकता होती है जो न्यूरोनल अस्तित्व, सिनैप्टोजेनेसिस, एक्सोनल भेदभाव, डेंड्राइटिक वास्तुकला और परिपक्वता को बढ़ावा देते हैं। इस प्रकार, चिकन भ्रूण श्रवण माइक्रोसर्किट के एक वैकल्पिक ब्रेनस्टेम वर्गों का उपयोग निम्नलिखित शोध विषयों के लिए किया जा सकता है: स्थलाकृतिक रूप से विभिन्न आयामों में न्यूरॉन्स का रूपात्मक संगठन; सभी श्रवण और वेस्टिबुलर नाभिक के कनेक्टोम का आयोजन और मानचित्रण; आईएसओ-आवृत्ति और टोनोटोपिक विमानों में सर्किट घटकों की गतिविधि पैटर्न की पहचान और लक्षण वर्णन; उत्तेजक बनाम निरोधात्मक माइक्रोसर्किट का स्थलाकृतिक संगठन और विशेष न्यूरॉन आबादी (नाभिक) के संबंध; श्रवण नाभिक न्यूरॉन्स का स्थानिक स्थान और इसके भविष्य कहनेवाला सीएफ17; विशिष्ट टोनोटोपिक न्यूरोनल प्रकारों का व्यवस्थित लक्ष्यीकरण; पूर्वज कोशिकाओं को ट्रैक करना और संरक्षित नाभिक में उनका विकास; न्यूरोनल सर्किट के विकास के लिए कोशिकाओं का आनुवंशिक वंश18; प्रजातियों के बीच तुलनात्मक ब्रेनस्टेम शरीर रचना विज्ञान; डिटर के वेस्टिबुलर कॉम्प्लेक्स (डीसी) जैसे वेस्टिबुलर सर्किट की जांच 19; और वेस्टिबुलर नाभिक के बीच सिंक्रनाइज़ेशन और क्रॉस टॉक।
विभिन्न स्लाइस विमानों का उपयोग करके एक बहुआयामी दृष्टिकोण ब्रेनस्टेम माइक्रोसर्किट के अज्ञात शारीरिक और बायोफिजिकल गुणों के बारे में मौलिक सवालों के जवाब देने में मदद कर सकता है। एक अच्छा उदाहरण प्रमुख श्रवण नाभिक (एनएम, एनए, एनएल और एसओएन) और वेस्टिबुलर नाभिक के बीच संबंध है, जिसमें पार्श्व लेम्निस्कस (एलएलडीपी) के पृष्ठीय नाभिक, अर्धचंद्र नाभिक (एसएलयू) 20 और स्पर्शरेखा नाभिक (टीएन) 3 शामिल हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल और इन टुकड़ा आधारित अध्ययनों की कुछ सीमाएं हैं।
सावधानियां और सीमाएं
प्रयोगों को करने वाली संस्था के आधार पर, नैतिक दिशानिर्देश और चिकन भ्रूण की हैंडलिंग अलग-अलग हो सकती है। जबकि प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देश संस्थान तेजी से विघटन की अनुमति देते हैं, चिकन भ्रूण इच्छामृत्यु21 के लिए वैकल्पिक तरीके हैं। प्रारंभिक विकासशील चिकन भ्रूण ब्रेनस्टेम ऊतक नरम है, और पुराने भ्रूण की तुलना में नाजुक है। इसमें सतह पर कई कनेक्शन और रक्त वाहिकाएं हैं जिन्हें हटाते समय अतिरिक्त सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है। ऊतक को बर्फ-ठंडे डीएसीएसएफ में रखा जाना चाहिए और व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए 95% ओ2/5% सीओ2 के साथ सुगंधित किया जाना चाहिए।
धनु टुकड़ा करने की विधि केवल इप्सिलेटरल टोनोटोपी के लिए उपयोगी है। यह टुकड़ा करने की क्रिया विधि कोरोनल स्लाइस की तुलना में बड़े स्लाइस प्रदान करती है, जिसकी हैंडलिंग अनिश्चित हो सकती है। हालांकि, कोई भी कहीं और विस्तार से वर्णित क्रॉस सुई विधियों का उपयोग करके स्लाइस को ट्रिम कर सकताहै 22. 4% एलएमपी एगारोज़ ब्लॉक एम्बेडेड ब्रेनस्टेम का उपयोग स्लाइस में नाजुक संरचनाओं को बचा सकता है, लेकिन अत्यधिक गर्म एगरोज़ डालने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए। ~ 1 मिनट के लिए एक ठंडा वातावरण में एगरोज़-अवरुद्ध ब्रेनस्टेम रखकर इसे जल्दी से सेट करना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए स्लाइस को अधिक व्यवहार्य बनाता है।
अधिक मात्रा में सुपरग्लू का अनुप्रयोग विषाक्त हो सकता है। इसे न्यूनतम रूप से लागू किया जाना चाहिए, और डीएसीएसएफ को बदलकर अधिशेष मात्रा को तुरंत धोया जाना चाहिए। तीव्र कोणीय (45 °) स्लाइस के लिए, एगरोज़ ब्लॉक के कोण को काटना महत्वपूर्ण है; एक तेज ब्लेड के साथ एगरोज़ ब्लॉक को काटते समय सामने के कोण को देखने के लिए एक दर्पण का उपयोग कर सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ब्लेड में एक मोम कोटिंग हो सकती है जिसे शराब से मिटा दिया जाना चाहिए और उपयोग से पहले सुखाया जाना चाहिए। वाइब्रेटोम काटने की गति और आवृत्ति के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है क्योंकि अक्षीय फाइबर टफ्ट्स कॉर्टिकल या मैट्रिक्स ऊतक की तुलना में कठिन होते हैं। एक उच्च आयाम रखने और ठंडा विच्छेदन समाधान का उपयोग ऊतक क्षति को रोक सकता है।
सभी समाधान ताजा तैयार किए जाने चाहिए, और सीए2 + और एमजी2 + को 95% ओ2/5% सीओ 2 को बुदबुदाने के बाद एसीएसएफ में जोड़ा जाना चाहिए। अन्यथा, सीए2+ की वर्षा हो सकती है। वाइब्रेटोम के भीतर धीरे-धीरे स्लाइस को संभालने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि संभव हो तो कुल टुकड़ा करने का समय 15 मिनट से कम रखें। ब्रेनस्टेम स्लाइस पैंतरेबाज़ी करने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग किया जा सकता है।
कांच के बने पदार्थ और उपकरणों के लिए डिटर्जेंट या संक्षारक धोने वाले एजेंटों का उपयोग न करें जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में उपयोग किए जाने वाले स्लाइस से संपर्क करते हैं। ली गई छवियां अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी के तहत 200-300 μM मोटी ऊतक की उपस्थिति का प्रतिनिधित्व करती हैं। दृश्य गुणवत्ता इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में खराब होगी, लेकिन यह सटीक रूप से दर्शाता है कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करते समय एक प्रयोगकर्ता क्या देखेगा।
वैकल्पिक शारीरिक अक्ष के साथ माइक्रोसर्किट के प्रारंभिक विकास से संबंधित अध्ययन, चाहे वे पृष्ठीय-उदर, रोस्ट्रल-पुच्छल, या इप्सिलेटरल-कॉन्ट्रालेटरल हों, चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम में सीमित हैं। इसका एक कारण यह है कि ब्रेनस्टेम में ट्रांसक्रिप्शनल कोड और टोनोटोपिक विकास के विनियमन की भूमिका अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। इन विट्रो में गतिविधि का अवलोकन करते समय टॉप-डाउन मॉडुलन और सहज गतिविधि जैसी कार्यात्मक घटनाएं अक्सर खो जाती हैं। हालांकि, विवो अनुसंधान में विशिष्ट और प्रत्यक्ष एकल न्यूरॉन रिकॉर्डिंग द्वारा पूरक है जो केवल इन टुकड़ा स्थितियों में संभव है। विभिन्न झुकावों के साथ ब्रेनस्टेम ऊतक प्राप्त करने का शोधन चिकन श्रवण ब्रेनस्टेम माइक्रोसर्किटरी में टोनोटोपिक ग्रेडिएंट के विकास और जटिलता के बारे में व्यावहारिक जानकारी प्रदान कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच /एनआईडीसीडी आर 01 डीसी 017167 अनुदान द्वारा समर्थित है। हम पांडुलिपि के पिछले संस्करण पर संपादकीय टिप्पणियां प्रदान करने के लिए क्रिस्टीन मैकलेलन को धन्यवाद देते हैं।
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