Her presenterer vi en protokoll for å skaffe ikke-koronale auditive hjernestammeskiver av kyllingembryoet for undersøkelse av tonotopiske egenskaper og utviklingsbaner innenfor en hjernestammeskive. Disse skivene inkluderer sagittale, horisontale og horisontale / tverrgående seksjoner som omfatter større tonotopiske regioner innenfor et individuelt skiveplan som de tradisjonelle koronale seksjonene.
Kyllingembryoet er en allment akseptert dyremodell for å studere den auditive hjernestammen, sammensatt av høyt spesialisert mikrokrets og nevrontopologi differensielt orientert langs en tonotopisk (dvs. frekvens) akse. Den tonotopiske aksen tillater segregert koding av høyfrekvente lyder i rostral-medialplanet og lavfrekvent koding i caudo-laterale regioner. Tradisjonelt tillater koronale hjernestammeskiver av embryonalt vev studiet av relativ individuell iso-frekvens lamina. Selv om det er tilstrekkelig til å undersøke anatomiske og fysiologiske spørsmål knyttet til individuelle isofrekvensregioner, er studiet av tonotopisk variasjon og dens utvikling over større auditive hjernestammeområder noe begrenset. Denne protokollen rapporterer hjernestammeskjæringsteknikker fra kyllingembryoer som omfatter større gradienter av frekvensregioner i den nedre auditive hjernestammen. Bruken av ulike skivemetoder for kylling auditivt hjernestammevev tillater elektrofysiologiske og anatomiske eksperimenter innenfor en hjernestammeskive, hvor større gradienter av tonotopiske egenskaper og utviklingsbaner er bedre bevart enn koronale seksjoner. Flere skiveteknikker muliggjør forbedret undersøkelse av de ulike anatomiske, biofysiske og tonotiske egenskapene til auditive hjernestammemikrokretser.
Kyllingembryoet er en verdifull forskningsmodell for å studere grunnleggende biologiske spørsmål på mange og forskjellige vitenskapelige områder, inkludert cellebiologi, immunologi, patologi og utviklingsnevrobiologi. Mikrokretsen til kyllingens auditive hjernestamme er et utmerket eksempel på en høyt spesialisert krets som kan forstås når det gjelder auditiv morfologi og fysiologi. For eksempel beskrev Rubel and Parks (1975) først den tonotopiske orienteringen (dvs. frekvensgradienten) av kyllingkjernen magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL) som en lineær funksjon over kjernens akse, orientert ~ 30 ° i forhold til sagittalplanet. Individuelle nevroner i NM og NL koder for sin beste lydfrekvens – kjent som deres karakteristiske frekvens (CF) – langs rostral-medialplanet til caudo-lateralområdet. Høyfrekvente følsomme nevroner er i rostral-mediale regionen og lavfrekvente følsomme nevroner ligger caudo-lateralt. Som sådan har tradisjonelle disseksjonsmetoder for auditivt hjernestammevev for å studere tonotiske egenskaper benyttet suksessive koronale skiver. Faktisk har auditive mikrokretser for å utvikle kyllingembryoer blitt etablert som et modellsystem for å studere signalbehandling av tonotopiske auditive funksjoner gjennom suksessive kaudal-til-rostral koronale plan hjernestammeskiver i flere tiår 1,2,3,4,5,6.
Den tonotopiske organiseringen av NM og NL er imidlertid topologisk og morfologisk innviklet. Hørselsnerveinnganger fordeles slik at høye CF-innganger avsluttes i endbulb-lignende strukturer som dekker minst en fjerdedel av en adendritisk NM-celles somatiske omkrets. Omvendt er lave CF-innganger ikke organisert med endepærelignende terminaler, men med flere boutonsynapser på dendritter av NM-nevroner. Midtre CF-innganger avsluttes som både endepære og boutonlignende synapser 4,7,8,9,10,11,12. I NL er den svært stereotype dendritiske gradienten tydelig ikke bare i dendritisk lengde, men også i dendritisk bredde. Denne unike dendritiske gradienten samsvarer tett med den tonotopiske aksen. Dendrittene gjennomgår en 11 ganger økning i lengde og fem ganger økning i bredde fra henholdsvis høy- til lav-CF-nevroner6. For å overvinne slike innviklede fordelinger av disse kjernene i koronale skiver, beskriver denne protokollen disseksjonstilnærminger i sagittale, horisontale og horisontale / tverrgående plan. Disse skiveteknikkene gir eksempler på auditivt hjernestammevev som viser maksimale tonotiske egenskaper i et individuelt skiveplan.
Koronale seksjoner av kyllingembryonalt hjernestammevev har gjort det mulig å studere relativ individuell isofrekvenslamina i flere tiår 1,2,5. Imidlertid er den tonotopiske (dvs. frekvens) organiseringen av kyllingens auditive hjernestamme topologisk innviklet og kan være mer tilgjengelig i andre anatomiske akser, avhengig av det spesifikke forskningsspørsmålet. Selv om det er tilstrekkelig til å undersøke anatomiske og fysiologiske spørsmål knyttet til individuelle isofrekvensregioner, er studiet av tonotopiske variasjoner og dets utvikling over større auditive hjernestammeområder noe begrenset av koronale seksjoner. For å overvinne denne begrensningen beskriver denne protokollen tilnærminger i sagittal, horisontale og horisontale / tverrgående plan for å gi ytterligere eksempler på auditivt hjernestammevev som viser maksimale tonotopiske egenskaper og gradienter i en individuell hjernestammeseksjon.
Sagittale seksjoner av auditive hjernestammeregioner viser at forskjellige tonotopiske områder er fordelt over en større region i skiven sammenlignet med koronale seksjoner (sagittalt hørselsområde = ~ 300-600 μm, koronalt hørselsområde = ~ 200-350 μm). For eksempel ble NM- og NL-regioner visualisert over et større område langs rostro-kaudalaksen i sagittale seksjoner (f.eks. Figur 2B), og den funksjonelle tonotopiske gradienten som går langs denne anatomiske aksen var i stor grad inneholdt i en enkelt sagittal skive. Dette ble videre bekreftet med nåværende klemmeopptak av inneboende nevronforskjeller som varierer langs rostral-kaudal gradient som tidligere rapportert14,15 (f.eks . Figur 3C, D). Fremtidige eksperimenter som fremhever anatomiske og immunhistokjemiske egenskaper langs den tonotopiske aksen, kan videre undersøke kjente gradienter av auditive egenskaper i et enkelt sagittalt skiveplan. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, MAP2-farging og kaliumkanaluttrykksmønstre, som er kjente gradienter av dendritisk arkitektur og iboende egenskaper til NM og NL som tidligere er vist i suksessive koronale seksjoner16.
Horisontale seksjoner av auditive hjernestammeregioner viser at NM og NL er plassert mot midtlinjen. En del av auditive aksonale fibre løper diagonalt eller vinkelrett på horisontalplanet (figur 4). Disse fibrene kan følges ved å lage en akutt vinkelskive 45 ° til sagittalplanet. De resulterende horisontale/tverrgående skivene var større enn sagittale eller horisontale skiver, og lange aksonale fibre gikk gjennom rostro-kaudalaksen for både ipsilaterale og kontralaterale sider. Både NM og NL kan visualiseres i et større diagonalt område (~ 400-700 μm) slik at kontralaterale forbindelser kan visualiseres langs en lateral-medial akse. I tillegg viser det horisontale/tverrgående skiveplanet også hvordan de auditive områdene og den resulterende tonotopiske gradienten gjør en vinkelsving (figur 5). Vinkeleksponering av kontralaterale forbindelser i et større område gjør disse skivene mer egnet for elektrofysiologisk stimulering og mikrokretsstudier enn tradisjonelle koronale skiver.
Ekstra fordeler
Dannelsen av auditive mikrokretser krever spatiotemporal koordinering av signaler som fremmer nevronoverlevelse, synaptogenese, aksonal differensiering, dendritisk arkitektur og modning. Dermed kan en alternativ hjernestammeseksjoner av kyllingembryoets auditive mikrokrets brukes til følgende forskningsemner: morfologisk organisering av nevroner i topografisk forskjellige dimensjoner; organisere og kartlegge forbindelsene til alle auditive og vestibulære kjerner; identifisering og karakterisering av aktivitetsmønstrene til kretsbestanddeler i iso-frekvens og tonotopiske plan; den topografiske organisasjonen av eksitatoriske versus hemmende mikrokretser og relasjoner til spesialiserte nevronpopulasjoner (kjerner); romlig plassering av auditive kjerneneuroner og dens prediktive CF17; systematisk målretting av spesifikke tonotopiske nevrontyper; sporing av stamceller og deres utvikling til konserverte kjerner; genetisk avstamning av celler til utviklingen av nevronkretser18; komparativ hjernestammeanatomi mellom arter; undersøkelse av vestibulære kretser som Deiters vestibulære kompleks (DC)19; og synkron og kryssprat mellom vestibulære kjerner.
En mangefasettert tilnærming ved hjelp av forskjellige skiveplan kan bidra til å svare på grunnleggende spørsmål om ukjente anatomiske og biofysiske egenskaper til hjernestammemikrokretser. Et godt eksempel er forholdet mellom store auditive kjerner (NM, NA, NL og SON) og vestibulære kjerner, inkludert dorsalkjernen til lateral lemniscus (LLDp), semilunarkjernen (SLu) 20 og tangentiell kjerne (TN) 3. Denne protokollen og disse skivebaserte studiene har imidlertid noen begrensninger.
Forholdsregler og begrensninger
Avhengig av hvilken institusjon som utfører forsøkene, kan etiske retningslinjer og håndtering av kyllingembryoer variere. Mens National Institutes of Health Guidelines for omsorg og bruk av forsøksdyr tillater rask halshugging, finnes det alternative metoder for kyllingembryo eutanasi21. Tidlig utvikling av kyllingembryo hjernestammevev er mykt og delikat sammenlignet med eldre embryoer. Den har flere tilkoblinger og blodårer på overflaten som trenger ekstra forsiktighet når du fjerner dem. Vev bør oppbevares i iskald dACSF og perfunderes med 95% O 2/5% CO2 for å øke levedyktigheten.
Sagittal skivemetoden er bare nyttig for ipsilateral tonotopi. Denne skivemetoden gir større skiver enn koronale skiver, hvis håndtering kan være usikker. Imidlertid kan man trimme skivene ved hjelp av kryssnålmetoder beskrevet i detalj andre steder22. Bruk av 4% LMP agaroseblokk innebygd hjernestamme kan redde delikate strukturer i skiver, men det må tas hensyn til ikke å helle for varmt agarose. Innstilling av den raskt ved å plassere den agaroseblokkerte hjernestammen i et kjølt miljø i ~ 1 min, gjør skiver mer levedyktige for elektrofysiologiske opptak.
Påføring av superlim i overskytende mengder kan være giftig. Det må påføres minimalt, og overskuddsmengder skal vaskes umiddelbart ved å bytte ut dACSF. For akutte kantede (45°) skiver er det kritisk å kutte vinkelen på agaroseblokken; Man kan bruke et speil for å se frontvinkelen mens man kutter agaroseblokken med et skarpt blad. Kommersielt tilgjengelige kniver kan ha et voksbelegg som bør tørkes av med alkohol og tørkes før bruk. Optimalisering er nødvendig for vibratome skjærehastighet og frekvens som aksonal fiber tufts er hardere enn kortikale eller matrise vev. Å holde en høy amplitude og bruke kjølt disseksjonsløsning kan forhindre vevskader.
Alle løsninger skal tilberedes ferske, og Ca 2+ og Mg2+ skal tilsettes ACSF etter boblende 95% O 2/5% CO 2. Ellers kan det være nedbør av Ca2+. En pensel skal brukes til å håndtere skivene forsiktig i vibratomet. Hold den totale skjæretiden under 15 min hvis mulig. En Pasteur-pipette i glass kan brukes til å manøvrere hjernestammeskiver.
Ikke bruk vaskemiddel eller etsende vaskemidler til glass og utstyr som kommer i kontakt med skivene som brukes i elektrofysiologien. Bildene som er tatt representerer utseendet til 200-300 μM tykt vev under differensiell interferenskontrast (DIC) optikk. Den visuelle kvaliteten vil være dårligere enn immunhistokjemi eller elektronmikroskopi, men den gjenspeiler nøyaktig hva en eksperimentør vil se når han utfører elektrofysiologiske opptak.
Studier knyttet til tidlig utvikling av mikrokretser langs en alternativ anatomisk akse, enten de er dorsal-ventral, rostral-caudal eller ipsilateral-contralateral, er begrenset i kyllingens auditive hjernestamme. En grunn til dette er fordi rollen som transkripsjonskoder og regulering av tonotisk utvikling i hjernestammen fortsatt ikke er fullt ut forstått. Funksjonelle fenomener som top-down modulering og spontan aktivitet går ofte tapt når man observerer aktivitet in vitro. In vivo-forskning suppleres imidlertid med spesifikke og direkte enkeltnevronopptak som bare er mulig under disse skiveforholdene. Forbedringen av å skaffe hjernestammevev langs forskjellige retninger kan gi innsiktsfull informasjon om utviklingen og kompleksiteten av tonotopiske gradienter i kylling auditiv hjernestamme mikrokrets.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av NIH/NIDCD R01 DC017167-tilskuddet. Vi takker Kristine McLellan for redaksjonelle kommentarer til en tidligere versjon av manuskriptet.
Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
Anti-vibration table 30"x 36" – OTMC – 63533 | TMC | ||
Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
Chemicals- list | |||
Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |