Aquí presentamos un protocolo para obtener cortes auditivos no coronales del tronco encefálico del embrión de pollo para la investigación de propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo dentro de un corte del tronco encefálico. Estos cortes incluyen secciones sagitales, horizontales y horizontales / transversales que abarcan regiones tonotópicas más grandes dentro de un plano de corte individual que las secciones coronales tradicionales.
El embrión de pollo es un modelo animal ampliamente aceptado para estudiar el tronco cerebral auditivo, compuesto por microcircuitos altamente especializados y topología neuronal orientada diferencialmente a lo largo de un eje tonotópico (es decir, frecuencia). El eje tonotópico permite la codificación segregada de sonidos de alta frecuencia en el plano rostral-medial y la codificación de baja frecuencia en regiones caudo-laterales. Tradicionalmente, las cortes coronales del tronco encefálico de tejido embrionario permiten el estudio de láminas de isofrecuencia individuales relativas. Aunque es suficiente para investigar cuestiones anatómicas y fisiológicas relacionadas con regiones individuales de isofrecuencia, el estudio de la variación tonotópica y su desarrollo en áreas auditivas más grandes del tronco encefálico es algo limitado. Este protocolo informa técnicas de corte del tronco encefálico de embriones de pollo que abarcan gradientes más grandes de regiones de frecuencia en el tronco cerebral auditivo inferior. La utilización de diferentes métodos de corte para el tejido auditivo del tronco encefálico del pollo permite experimentos electrofisiológicos y anatómicos dentro de un corte del tronco encefálico, donde los gradientes más grandes de propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo se conservan mejor que las secciones coronales. Múltiples técnicas de corte permiten una mejor investigación de las diversas propiedades anatómicas, biofísicas y tonotópicas de los microcircuitos auditivos del tronco encefálico.
El embrión de pollo es un valioso modelo de investigación para estudiar cuestiones biológicas básicas en numerosas y diversas áreas científicas, incluyendo biología celular, inmunología, patología y neurobiología del desarrollo. El microcircuito del tronco encefálico auditivo del pollo es un excelente ejemplo de un circuito altamente especializado que puede entenderse en términos de morfología y fisiología auditiva. Por ejemplo, Rubel y Parks (1975) describieron por primera vez la orientación tonotópica (es decir, gradiente de frecuencia) del núcleo magnocelular del pollo (NM) y el núcleo laminar (NL) como una función lineal a través del eje de los núcleos, orientada ~ 30 ° con respecto al plano sagital. Las neuronas individuales en NM y NL codifican su mejor frecuencia de sonido, conocida como su frecuencia característica (CF), a lo largo del plano rostral-medial hasta la región caudo-lateral. Las neuronas sensibles a la alta frecuencia se encuentran en la región rostral-medial y las neuronas sensibles a la baja frecuencia se encuentran caudolateralmente. Como tal, los métodos tradicionales de disección del tejido auditivo del tronco encefálico para estudiar las propiedades tonotópicas han utilizado cortes coronales sucesivos. De hecho, los microcircuitos auditivos de embriones de pollo en desarrollo se han establecido como un sistema modelo para estudiar el procesamiento de señales de las funciones auditivas tonotópicas a través de sucesivas cortes del tronco encefálico del plano coronal caudal a rostral durante décadas 1,2,3,4,5,6.
Sin embargo, la organización tonotópica de NM y NL es topológica y morfológicamente complicada. Las entradas nerviosas auditivas se distribuyen de tal manera que las altas entradas de CF terminan en estructuras similares a bulbos terminales que cubren al menos una cuarta parte de la circunferencia somática de una célula NM adendrítica. Por el contrario, las entradas bajas de CF no están organizadas con terminales finales similares a bulbos, sino con múltiples sinapsis de bouton en dendritas de neuronas NM. Las entradas de CF medio terminan como sinapsisde bulbo final y bouton 4,7,8,9,10,11,12. En NL, el gradiente dendrítico altamente estereotipado es evidente no solo en la longitud dendrítica sino también en el ancho dendrítico. Este gradiente dendrítico único se ajusta estrechamente al eje tonotópico. Las dendritas experimentan un aumento de 11 veces en longitud y cinco veces en anchura de neuronas de alta a baja CF, respectivamente6. Para superar tales distribuciones complicadas de estos núcleos en cortes coronales, este protocolo describe enfoques de disección en los planos sagital, horizontal y horizontal/transversal. Estas técnicas de corte proporcionan ejemplos de tejido auditivo del tronco encefálico que exhiben propiedades tonotópicas máximas en un plano de corte individual.
Las secciones coronales del tejido embrionario del tronco encefálico del pollo han permitido el estudio de la lámina de isofrecuencia individual relativa durante décadas 1,2,5. Sin embargo, la organización tonotópica (es decir, la frecuencia) del tronco encefálico auditivo del pollo es topológicamente complicada y puede ser más accesible en otros ejes anatómicos dependiendo de la pregunta de investigación específica. Aunque es suficiente para investigar cuestiones anatómicas y fisiológicas relacionadas con regiones individuales de isofrecuencia, el estudio de las variaciones tonotópicas y su desarrollo en áreas auditivas más grandes del tronco encefálico están algo limitados por las secciones coronales. Para superar esta limitación, este protocolo describe enfoques en los planos sagital, horizontal y horizontal/transversal para proporcionar ejemplos adicionales de tejido auditivo del tronco encefálico que exhiben propiedades tonotópicas máximas y gradientes en una sección individual del tronco encefálico.
Las secciones sagitales de las regiones auditivas del tronco encefálico muestran que diferentes áreas tonotópicas se distribuyen en una región más grande dentro del corte en comparación con las secciones coronales (área auditiva sagital = ~ 300-600 μm, área auditiva coronal = ~ 200-350 μm). Por ejemplo, las regiones NM y NL se visualizaron en un área más grande a lo largo del eje rostro-caudal en secciones sagitales (por ejemplo, Figura 2B), y el gradiente tonotópico funcional que corre a lo largo de este eje anatómico estaba contenido en gran medida dentro de un solo corte sagital. Esto se confirmó aún más con registros de pinza de corriente de diferencias neuronales intrínsecas que varían a lo largo del gradiente rostral-caudal como se informó anteriormente14,15 (por ejemplo, Figura 3C, D). Los experimentos futuros que resalten las propiedades anatómicas e inmunohistoquímicas a lo largo del eje tonotópico podrían investigar más a fondo los gradientes conocidos de las propiedades auditivas dentro de un solo plano de corte sagital. Estos incluyen, pero no se limitan a, tinción MAP2 y patrones de expresión de canales de potasio, que son gradientes conocidos de arquitectura dendrítica y propiedades intrínsecas de NM y NL que se han demostrado previamente en secciones coronales sucesivas16.
Las secciones horizontales de las regiones auditivas del tronco encefálico muestran que el NM y el NL están ubicados hacia la línea media. Una porción de fibras axonales auditivas corre diagonal o perpendicular al plano horizontal (Figura 4). Estas fibras pueden ser seguidas haciendo un corte angular agudo de 45° al plano sagital. Los cortes horizontales/transversales resultantes eran más grandes que los cortes sagitales u horizontales, y las fibras axonales largas corrían a través del eje rostro-caudal tanto para el lado ipsilateral como para el contralateral. Tanto NM como NL se pueden visualizar en una región diagonal más grande (~ 400-700 μm) de modo que las conexiones contralaterales se pueden visualizar a lo largo de un eje lateral-medial. Además, el plano de corte horizontal/transversal también muestra cómo las regiones auditivas y el gradiente tonotópico resultante hacen un giro angular (Figura 5). La exposición angular de las conexiones contralaterales en un área más grande hace que estos cortes sean más adecuados para la estimulación electrofisiológica y los estudios de microcircuitos que los cortes coronales tradicionales.
Ventajas adicionales
La formación de microcircuitos auditivos requiere la coordinación espaciotemporal de señales que promueven la supervivencia neuronal, la sinaptogénesis, la diferenciación axonal, la arquitectura dendrítica y la maduración. Por lo tanto, se pueden utilizar secciones alternativas del microcircuito auditivo del tronco encefálico del embrión de pollo para los siguientes temas de investigación: organización morfológica de neuronas en dimensiones topográficamente diferentes; organizar y mapear los conectomas de todos los núcleos auditivos y vestibulares; identificación y caracterización de los patrones de actividad de los constituyentes de circuitos en planos de isofrecuencia y tonotópicos; la organización topográfica de microcircuitos excitatorios versus inhibitorios y relaciones con poblaciones de neuronas especializadas (núcleos); localización espacial de las neuronas de los núcleos auditivos y su CFpredictiva 17; focalización sistemática de tipos neuronales tonotópicos específicos; seguimiento de las células progenitoras y su desarrollo en núcleos conservados; linaje genético de las células a la evolución de los circuitos neuronales18; anatomía comparativa del tronco encefálico entre especies; investigación de circuitos vestibulares como el complejo vestibular de Deiter (DC)19; y sincronía y diafonía entre núcleos vestibulares.
Un enfoque multifacético que utiliza diferentes planos de corte puede ayudar a responder preguntas fundamentales sobre propiedades anatómicas y biofísicas desconocidas de los microcircuitos del tronco encefálico. Un buen ejemplo es la relación entre los principales núcleos auditivos (NM, NA, NL y SON) y los núcleos vestibulares, incluyendo el núcleo dorsal del lemniscus lateral (LLDp), el núcleo semilunar (SLu)20 y el núcleo tangencial (TN)3. Sin embargo, este protocolo y estos estudios basados en cortes tienen algunas limitaciones.
Precauciones y limitaciones
Dependiendo de la institución que realiza los experimentos, las pautas éticas y el manejo de embriones de pollo pueden diferir. Mientras que las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio permiten la decapitación rápida, existen métodos alternativos para la eutanasia de embriones de pollo21. El tejido del tronco encefálico del embrión de pollo en desarrollo temprano es suave y delicado en comparación con los embriones más viejos. Tiene varias conexiones y vasos sanguíneos en la superficie que necesitan precaución adicional al eliminarlos. El tejido debe mantenerse en dACSF helado y perfundirse con 95% de O2/5% deCO2 para aumentar la viabilidad.
El método de corte sagital solo es útil para la tonotopía ipsilateral. Este método de corte proporciona cortes más grandes que los cortes coronales, cuyo manejo podría ser precario. Sin embargo, se pueden recortar las rodajas utilizando métodos de agujas cruzadas descritos en detalle en otra parte22. El uso de un 4% de tronco encefálico incrustado en el bloque de agarosa LMP puede salvar estructuras delicadas en rodajas, pero se debe tener cuidado de no verter agarosa excesivamente caliente. Configurarlo rápidamente colocando el tronco encefálico bloqueado con agarosa en un ambiente frío durante ~ 1 minuto hace que las rebanadas sean más viables para las grabaciones electrofisiológicas.
La aplicación de superglue en cantidades excesivas puede ser tóxica. Debe aplicarse mínimamente, y las cantidades excedentes deben lavarse inmediatamente cambiando el dACSF. Para cortes angulares agudos (45°), cortar el ángulo del bloque de agarosa es crítico; Uno puede usar un espejo para ver el ángulo frontal mientras corta el bloque de agarosa con una cuchilla afilada. Las cuchillas disponibles comercialmente pueden tener un recubrimiento de cera que debe limpiarse con alcohol y secarse antes de su uso. Se requiere optimización para la velocidad y frecuencia de corte del vibratomo, ya que los mechones de fibra axonal son más duros que el tejido cortical o matriz. Mantener una amplitud alta y usar una solución de disección refrigerada puede prevenir el daño tisular.
Todas las soluciones deben prepararse frescas, y Ca 2+ y Mg2+ deben añadirse al ACSF después de burbujear 95% O 2/5% CO2 . De lo contrario, puede haber precipitación de Ca2+. Se debe usar un pincel para manejar las rodajas suavemente dentro del vibratomo. Mantenga el tiempo total de corte por debajo de 15 minutos si es posible. Se puede utilizar una pipeta de vidrio Pasteur para maniobrar cortes del tronco encefálico.
No utilice detergente ni agentes de lavado corrosivos para cristalería y equipos que entren en contacto con las rodajas utilizadas en electrofisiología. Las imágenes tomadas representan la apariencia de tejido de 200-300 μM de espesor bajo óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC). La calidad visual será más pobre que la inmunohistoquímica o la microscopía electrónica, pero refleja con precisión lo que un experimentador verá al realizar registros electrofisiológicos.
Los estudios relacionados con el desarrollo temprano de microcircuitos a lo largo de un eje anatómico alternativo, ya sean dorsal-ventral, rostral-caudal o ipsilateral-contralateral, están limitados en el tronco cerebral auditivo del pollo. Una razón para esto es porque el papel de los códigos transcripcionales y la regulación del desarrollo tonotópico en el tronco encefálico aún no se comprende completamente. Los fenómenos funcionales como la modulación de arriba hacia abajo y la actividad espontánea a menudo se pierden cuando se observa la actividad in vitro. Sin embargo, la investigación in vivo se complementa con registros específicos y directos de neuronas individuales que solo son posibles en estas condiciones de corte. El refinamiento de la obtención de tejido del tronco encefálico a lo largo de diferentes orientaciones podría proporcionar información perspicaz sobre el desarrollo y la complejidad de los gradientes tonotópicos en los microcircuitos auditivos del tronco encefálico del pollo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es apoyado por la subvención NIH/NIDCD R01 DC017167. Agradecemos a Kristine McLellan por proporcionar comentarios editoriales sobre una versión anterior del manuscrito.
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