Bu protokol, küçük ölçekli AAV üretimi, intravitreal enjeksiyon, retina görüntüleme ve retina genomik DNA izolasyonu ile birlikte dijital damlacık PCR (dd-PCR) kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyon verimliliğinin nasıl ölçüleceğini sunar.
Birçok retina hücre biyolojisi laboratuvarı artık gen düzenleme ve düzenleyici uygulamalar için rutin olarak Adeno ile ilişkili virüsler (AAV’ ler) kullanmaktadır. AAV transdüksiyonunun verimliliği genellikle kritiktir ve bu da genel deneysel sonuçları etkiler. Transdüksiyon verimliliği için ana belirleyicilerden biri AAV vektörün serotipi veya varyantıdır. Şu anda, hücre yüzey reseptörlerini barındırmak için farklı benzeşimlere sahip çeşitli yapay AAV serotipleri ve varyantları mevcuttur. Retina gen tedavisi için bu, farklı retina hücre tipleri için çeşitli derecelerde transdüksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Ayrıca enjeksiyon yolu ve AAV üretiminin kalitesi retina AAV transdüksiyon verimliliklerini de etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantların, partilerin ve metodolojilerin verimliliğini karşılaştırmak önemlidir. Dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemi, nükleik asitleri yüksek hassasiyetle ölçerek belirli bir hedefin herhangi bir standart veya referans olmadan mutlak nicelleştirilmesini sağlar. DD-PCR kullanılarak, enjekte edilen bir retinadaki AAV genom kopya numaralarının mutlak nicelleştirilmesiyle AAV’lerin transdüksiyon verimliliklerini değerlendirmek de mümkündür. Burada, dd-PCR kullanarak retina hücrelerindeki AAV’lerin transdüksiyon oranını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Küçük değişikliklerle, bu metodoloji, mitokondriyal DNA’nın kopya sayısı nicelliğinin yanı sıra, birkaç retina hastalığı ve gen tedavisi uygulaması için kritik olan baz düzenlemenin verimliliğini değerlendirmenin de temelini oluşturabilir.
Adeno ilişkili virüsler (AAV’ler) artık çeşitli retina gen tedavisi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. AAV’ler, daha az immünojeniklik ve daha az genom entegrasyonu ile güvenli ve verimli bir gen iletim yolu sağlar. Hedef hücreye AAV girişi, hücre yüzeyindeki reseptörlerin ve yardımcı reseptörlerin bağlanmasını gerektiren endositoz yoluylagerçekleşir 1,2. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için AAV’lerin transdüksiyon verimliliği esas olarak kapsid ve konak hücre reseptörleri ile etkileşimlerine bağlıdır. AAV’lerin serotipleri vardır ve her serotip farklı hücresel/doku trompilerine ve transdüksiyon verimliliklerine sahip olabilir. Ayrıca virüs kapsid kimyasal modifikasyonu, hibrid kapsid üretimi, peptit ekleme, kapsid karıştırma, yönlendirilmiş evrim ve rasyonel mutajensis3tarafından oluşturulan yapay AAV serotipleri ve varyantları vardır. Amino asit dizisindeki veya kapsid yapısındaki küçük değişiklikler bile konak hücre faktörleri ile etkileşimler üzerinde bir etkiye sahip olabilir ve farklı tromizmlere neden olabilir4. Kapsid varyantlarına ek olarak, enjeksiyon rotası ve AAV üretiminin toplu olarak parçalanması gibi diğer faktörler, AAV’lerin nöronal retinadaki transdüksiyon verimliliğini etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantlar için transdüksiyon oranlarının karşılaştırılması için güvenilir yöntemler gereklidir.
AAV transdüksiyon verimliliğini belirleme yöntemlerinin çoğu muhabir gen ekspresyonine dayanır. Bunlar floresan görüntüleme, immünohistokimya, batı lekesi veya muhabir gen ürününün histokimyasal analizi5,6,7içerir. Bununla birlikte, AAV’lerin boyut kısıtlaması nedeniyle, transdüksiyon verimliliğini izlemek için muhabir genlerini dahil etmek her zaman mümkün değildir. Hibrid CMV enhancer / tavuk beta-actin veya Woodchuck hepatit transkripsiyonel düzenleyici eleman (WPRE) gibi güçlü promotörleri bir mRNA stabilizatör dizisi olarak kullanmak boyut problemini daha da karmaşık hale gelir8. Bu nedenle, enjekte edilen AAV’lerin transdüksiyon oranını daha doğrudan bir metodoloji ile tanımlamak da faydalı olacaktır.
Dijital damlacık PCR (dd-PCR), hedef DNA’yı dakika miktarda numuneden ölçmek için güçlü bir tekniktir. dd-PCR teknolojisi, hedef DNA ve PCR reaksiyon karışımının yağ damlacıkları ile kapsüllenmesine bağlıdır. Her dd-PCR reaksiyonı binlerce damlacık içerir. Her damlacık bağımsız bir PCR reaksiyon9olarak işlenir ve analiz edilir. Damlacıkların analizi, sadece Poisson algoritmasını kullanarak herhangi bir örnekteki hedef DNA moleküllerinin mutlak kopya sayısının hesaplanmasına olanak tanır. AAV’lerin transdüksiyon verimliliği nöronal retinadaki AAV genomlarının kopya sayısı ile ilişkili olduğundan, AAV genomlarını ölçmek için dd-PCR yöntemini kullandık.
Burada, retinal genomik DNA6,10’danAAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için bir dd-PCR metodolojisini açıklıyoruz. İlk olarak, tdTomato muhabirini ifade eden AAV’ler küçük ölçekli protokol kullanılarak oluşturulmuş ve dd-PCR yöntemi11ile titrilmiştir. İkincisi, AAV’ler intravitreal olarak nöronal retinaya enjekte edildi. Transdüksiyon verimliliğini göstermek için ilk olarak floresan mikroskopi ve ImageJ yazılımı kullanarak tdTomato ekspresyonını ölçtük. Bunu, DD-PCR kullanılarak enjekte edilen retinalarda AAV genomlarının nicelleştirilmesi için genomik DNA’nın izolasyonu izledi. tdTomato ekspresyon seviyelerinin dd-PCR ile ölçülen transdüklenmiş AAV genomları ile karşılaştırılması, dd-PCR yönteminin AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini doğru bir şekilde ölçtüğü göstermiştir. Protokollerimiz, AAV transdüksiyon verimliliklerini ölçmek için dd-PCR tabanlı bir metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasını göstermiştir. Bu protokolde ayrıca intravitreal enjeksiyonlardan sonra sadece genomik DNA izolasyonu ve dd-PCR sonuçlarından sonra seyreltme faktörü kullanılarak transdüklenen mutlak AAV genom sayısını gösteriyoruz. Genel olarak, bu protokol retinadaki AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini ölçmek için muhabir ifadesine alternatif olacak güçlü bir yöntem sağlar.
Bu protokolde farklı kapsid proteinleri olan iki AAV vektörü oluşturduk ve daha sonra bunları buna göre titrettirdik. Bu protokolün en önemli adımlarından biri, transdüksiyon12,13’densonra algılanabilir muhabir ifadesi verecek yeterli miktarda AAV üretmektir.
AAV’lerin titeringi de intravitreal enjeksiyonlar için AAV dozajlarını ayarlamak için önemli bir faktördür. Bu önemli kriterlere ulaşıldıktan sonra, AAV…
The authors have nothing to disclose.
Oezkan Keles, Josephine Jüttner ve Prof. Botond Roska’ya, Moleküler ve Klinik Oftalmoloji Enstitüsü Basel, Karmaşık Virüsler Platformu’na AAV üretimine verdikleri yardım ve destek için teşekkür ederiz. Ayrıca AAV8/BP2 suşu için Pennsylvania Üniversitesi Perelman Tıp Fakültesi’nden Prof. Jean Bennett’e teşekkür ederiz. Gebze Teknik Üniversitesi hayvan tesisinde hayvan çalışması yapılmaktadır. Bunun için Leyla Dikmetaş ve Prof. Dr. Uygar Halis Tazebay’a hayvancılığa yönelik teknik yardım ve destekleri için teşekkür ediyoruz. Dr. Fatma Özdemir’e de el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma TübİtAK, 118C226 ve 121N275 hibe numaraları ve Sabancı Üniversitesi Entegrasyon hibesi ile desteklenmektedir.
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
Isoflurane | ADEKA ![]() ![]() ![]() ![]() |
N01AB06 | anesthetic |
Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim ![]() ![]() |
S01FA06 | pupil dilation |
Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |