Murine Retina'da AAV Transdüksiyon Verimliliğinin Nicelleştirilmesi için Dijital Damlacık PCR Yöntemi
Summary
Bu protokol, küçük ölçekli AAV üretimi, intravitreal enjeksiyon, retina görüntüleme ve retina genomik DNA izolasyonu ile birlikte dijital damlacık PCR (dd-PCR) kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyon verimliliğinin nasıl ölçüleceğini sunar.
Abstract
Birçok retina hücre biyolojisi laboratuvarı artık gen düzenleme ve düzenleyici uygulamalar için rutin olarak Adeno ile ilişkili virüsler (AAV’ ler) kullanmaktadır. AAV transdüksiyonunun verimliliği genellikle kritiktir ve bu da genel deneysel sonuçları etkiler. Transdüksiyon verimliliği için ana belirleyicilerden biri AAV vektörün serotipi veya varyantıdır. Şu anda, hücre yüzey reseptörlerini barındırmak için farklı benzeşimlere sahip çeşitli yapay AAV serotipleri ve varyantları mevcuttur. Retina gen tedavisi için bu, farklı retina hücre tipleri için çeşitli derecelerde transdüksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Ayrıca enjeksiyon yolu ve AAV üretiminin kalitesi retina AAV transdüksiyon verimliliklerini de etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantların, partilerin ve metodolojilerin verimliliğini karşılaştırmak önemlidir. Dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemi, nükleik asitleri yüksek hassasiyetle ölçerek belirli bir hedefin herhangi bir standart veya referans olmadan mutlak nicelleştirilmesini sağlar. DD-PCR kullanılarak, enjekte edilen bir retinadaki AAV genom kopya numaralarının mutlak nicelleştirilmesiyle AAV’lerin transdüksiyon verimliliklerini değerlendirmek de mümkündür. Burada, dd-PCR kullanarak retina hücrelerindeki AAV’lerin transdüksiyon oranını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Küçük değişikliklerle, bu metodoloji, mitokondriyal DNA’nın kopya sayısı nicelliğinin yanı sıra, birkaç retina hastalığı ve gen tedavisi uygulaması için kritik olan baz düzenlemenin verimliliğini değerlendirmenin de temelini oluşturabilir.
Introduction
Adeno ilişkili virüsler (AAV’ler) artık çeşitli retina gen tedavisi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. AAV’ler, daha az immünojeniklik ve daha az genom entegrasyonu ile güvenli ve verimli bir gen iletim yolu sağlar. Hedef hücreye AAV girişi, hücre yüzeyindeki reseptörlerin ve yardımcı reseptörlerin bağlanmasını gerektiren endositoz yoluylagerçekleşir 1,2. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için AAV’lerin transdüksiyon verimliliği esas olarak kapsid ve konak hücre reseptörleri ile etkileşimlerine bağlıdır. AAV’lerin serotipleri vardır ve her serotip farklı hücresel/doku trompilerine ve transdüksiyon verimliliklerine sahip olabilir. Ayrıca virüs kapsid kimyasal modifikasyonu, hibrid kapsid üretimi, peptit ekleme, kapsid karıştırma, yönlendirilmiş evrim ve rasyonel mutajensis3tarafından oluşturulan yapay AAV serotipleri ve varyantları vardır. Amino asit dizisindeki veya kapsid yapısındaki küçük değişiklikler bile konak hücre faktörleri ile etkileşimler üzerinde bir etkiye sahip olabilir ve farklı tromizmlere neden olabilir4. Kapsid varyantlarına ek olarak, enjeksiyon rotası ve AAV üretiminin toplu olarak parçalanması gibi diğer faktörler, AAV’lerin nöronal retinadaki transdüksiyon verimliliğini etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantlar için transdüksiyon oranlarının karşılaştırılması için güvenilir yöntemler gereklidir.
AAV transdüksiyon verimliliğini belirleme yöntemlerinin çoğu muhabir gen ekspresyonine dayanır. Bunlar floresan görüntüleme, immünohistokimya, batı lekesi veya muhabir gen ürününün histokimyasal analizi5,6,7içerir. Bununla birlikte, AAV’lerin boyut kısıtlaması nedeniyle, transdüksiyon verimliliğini izlemek için muhabir genlerini dahil etmek her zaman mümkün değildir. Hibrid CMV enhancer / tavuk beta-actin veya Woodchuck hepatit transkripsiyonel düzenleyici eleman (WPRE) gibi güçlü promotörleri bir mRNA stabilizatör dizisi olarak kullanmak boyut problemini daha da karmaşık hale gelir8. Bu nedenle, enjekte edilen AAV’lerin transdüksiyon oranını daha doğrudan bir metodoloji ile tanımlamak da faydalı olacaktır.
Dijital damlacık PCR (dd-PCR), hedef DNA’yı dakika miktarda numuneden ölçmek için güçlü bir tekniktir. dd-PCR teknolojisi, hedef DNA ve PCR reaksiyon karışımının yağ damlacıkları ile kapsüllenmesine bağlıdır. Her dd-PCR reaksiyonı binlerce damlacık içerir. Her damlacık bağımsız bir PCR reaksiyon9olarak işlenir ve analiz edilir. Damlacıkların analizi, sadece Poisson algoritmasını kullanarak herhangi bir örnekteki hedef DNA moleküllerinin mutlak kopya sayısının hesaplanmasına olanak tanır. AAV’lerin transdüksiyon verimliliği nöronal retinadaki AAV genomlarının kopya sayısı ile ilişkili olduğundan, AAV genomlarını ölçmek için dd-PCR yöntemini kullandık.
Burada, retinal genomik DNA6,10’danAAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için bir dd-PCR metodolojisini açıklıyoruz. İlk olarak, tdTomato muhabirini ifade eden AAV’ler küçük ölçekli protokol kullanılarak oluşturulmuş ve dd-PCR yöntemi11ile titrilmiştir. İkincisi, AAV’ler intravitreal olarak nöronal retinaya enjekte edildi. Transdüksiyon verimliliğini göstermek için ilk olarak floresan mikroskopi ve ImageJ yazılımı kullanarak tdTomato ekspresyonını ölçtük. Bunu, DD-PCR kullanılarak enjekte edilen retinalarda AAV genomlarının nicelleştirilmesi için genomik DNA’nın izolasyonu izledi. tdTomato ekspresyon seviyelerinin dd-PCR ile ölçülen transdüklenmiş AAV genomları ile karşılaştırılması, dd-PCR yönteminin AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini doğru bir şekilde ölçtüğü göstermiştir. Protokollerimiz, AAV transdüksiyon verimliliklerini ölçmek için dd-PCR tabanlı bir metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasını göstermiştir. Bu protokolde ayrıca intravitreal enjeksiyonlardan sonra sadece genomik DNA izolasyonu ve dd-PCR sonuçlarından sonra seyreltme faktörü kullanılarak transdüklenen mutlak AAV genom sayısını gösteriyoruz. Genel olarak, bu protokol retinadaki AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini ölçmek için muhabir ifadesine alternatif olacak güçlü bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde farklı kapsid proteinleri olan iki AAV vektörü oluşturduk ve daha sonra bunları buna göre titrettirdik. Bu protokolün en önemli adımlarından biri, transdüksiyon12,13’densonra algılanabilir muhabir ifadesi verecek yeterli miktarda AAV üretmektir.
AAV’lerin titeringi de intravitreal enjeksiyonlar için AAV dozajlarını ayarlamak için önemli bir faktördür. Bu önemli kriterlere ulaşıldıktan sonra, AAV…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Oezkan Keles, Josephine Jüttner ve Prof. Botond Roska’ya, Moleküler ve Klinik Oftalmoloji Enstitüsü Basel, Karmaşık Virüsler Platformu’na AAV üretimine verdikleri yardım ve destek için teşekkür ederiz. Ayrıca AAV8/BP2 suşu için Pennsylvania Üniversitesi Perelman Tıp Fakültesi’nden Prof. Jean Bennett’e teşekkür ederiz. Gebze Teknik Üniversitesi hayvan tesisinde hayvan çalışması yapılmaktadır. Bunun için Leyla Dikmetaş ve Prof. Dr. Uygar Halis Tazebay’a hayvancılığa yönelik teknik yardım ve destekleri için teşekkür ediyoruz. Dr. Fatma Özdemir’e de el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma TübİtAK, 118C226 ve 121N275 hibe numaraları ve Sabancı Üniversitesi Entegrasyon hibesi ile desteklenmektedir.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referências
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).
