이 프로토콜은 작은 규모의 AAV 생산, 인트라비탈 주사, 망막 이미징 및 망막 게놈 DNA 격리와 함께 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환 효율을 정량화하는 방법을 제시합니다.
많은 망막 세포 생물학 실험실은 지금 일상적으로 유전자 편집 및 규제 응용을 위해 Adeno 관련 바이러스 (AAV)를 이용합니다. AAV 트랜스듀션의 효율성은 일반적으로 중요하며, 이는 전반적인 실험 결과에 영향을 미칩니다. 트랜스듀션 효율을 위한 주요 결정요인 중 하나는 AAV 벡터의 혈청형 또는 변형이다. 현재, 다양한 인공 AAV 혈청형 및 변이체는 세포 표면 수용체를 호스트하기 위해 상이한 친화력으로 사용할 수 있다. 망막 유전자 치료를 위해, 이것은 다른 망막 세포 모형을 위한 transction 효율성의 다양한 정도에서 초래합니다. 또한, 사출 경로 및 AAV 생산의 품질은 또한 망막 AAV 변환 효율성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 다양한 변형, 배치 및 방법론의 효율성을 비교하는 것이 필수적입니다. 디지털 물방울 PCR(dd-PCR) 방법은 핵산을 고정밀으로 정량화하고 표준이나 기준 없이 주어진 표적의 절대 정량화를 수행할 수 있게 한다. dd-PCR을 사용하면 주입된 망막 내에서 AAV 게놈 카피 번호를 절대적인 정량화하여 AAV의 트랜스듀션 효율성을 평가하는 것도 가능하다. 여기서, 우리는 dd-PCR를 사용하여 망막 세포에서 AAV의 변환 속도를 정량화하는 간단한 방법을 제공합니다. 사소한 수정으로, 이 방법론은 또한 미토콘드리아 DNA의 복사 수 정량화뿐만 아니라 여러 망막 질환 및 유전자 치료 응용 프로그램에 중요한 기본 편집의 효율성을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.
Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 지금 일반적으로 망막 유전자 치료 연구의 각종을 위해 이용됩니다. AAV는 면역genicity및 적은 게놈 통합을 가진 유전자 전달의 안전하고 효율적인 방법을 제공합니다. 표적 세포로의 AAV 진입은 세포 표면1,2에수용체 및 공동 수용체의 결합을 요구하는 내분비증을 통해 발생합니다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 AAV의 변환 효율은 주로 캡시드 및 숙주 세포 수용체와의 상호 작용에 달려 있다. AAV는 혈청형을 가지고 있으며 각 혈청형은 뚜렷한 세포/조직 트로피즘과 전관 효율을 가질 수 있습니다. 또한 바이러스 캡시드의 화학적 변형, 하이브리드 캡시드 생산, 펩타이드 삽입, 캡시드 셔플, 지향진화, 합리적 돌연변이발생3의화학적 변형에 의해 생성된 인공 AAV 혈청형 및 변이체도 있다. 아미노산 서열 또는 캡시드 구조의 사소한 변화조차도 숙주 세포 인자와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며 다른 트로피4를 초래할 수 있다. 캡시드 변이체 외에도, AAV 생산의 사출 경로 및 배치 간 변화와 같은 다른 요인은 신경 망막에서 AAV의 변환 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 다른 변종에 대한 변환 속도의 비교를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다.
AAV 트랜스듀션 효율을 결정하는 대부분의 방법은 리포터 유전자 발현에 의존한다. 이들은 리포터 유전자생성물의형광 화상 진찰, 면역히스토케, 서양 얼룩, 또는 화학적 분석을포함5,6,7. 그러나, AAV의 크기 제약으로 인해, 트랜스듀션 효율을 모니터링하기 위해 기자 유전자를 포함하는 것이 항상 가능하지는 않다. mRNA 안정기 서열로서 하이브리드 CMV 증강제/닭 베타-액틴 또는 우드척 형 간염 조절 원소(WPRE)와 같은 강력한 프로모터를 사용하면 크기 문제를 더욱 복잡하게 만든다8. 따라서 보다 직접적인 방법론으로 주입된 AAV의 트랜스듀션 속도를 정의하는 것도 도움이 될 것이다.
디지털 물방울 PCR (dd-PCR)은 미세한 양의 샘플에서 표적 DNA를 정량화하는 강력한 기술입니다. dd-PCR 기술은 오일 방울에 의한 표적 DNA 및 PCR 반응 혼합물의 캡슐화에 의존한다. 각 dd-PCR 반응에는 수천 개의 물방울이 포함되어 있습니다. 각 액적은 독립적인 PCR 반응9로처리되고 분석된다. 물방울의 분석은 푸아송 알고리즘을 사용하여 모든 샘플에서 표적 DNA 분자의 절대 복사 수를 계산할 수 있습니다. AAV의 트랜스듀션 효율은 뉴런 망막에서 AAV 게놈의 카피 수와 상관관계가 있기 때문에 DD-PCR 방법을 사용하여 AAV 게놈을 정량화했습니다.
여기서, 우리는 망막 게놈 DNA6,10로부터AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 계산하기 위해 dd-PCR 방법론을 설명한다. 먼저, tdTomato 리포터를 표현하는 AAV는 소규모 프로토콜을 사용하여 생성되었고, dd-PCR방법(11)에의해 적발되었다. 둘째, AAV는 신경 망막에 주입되었습니다. 트랜스듀션 효율을 입증하기 위해, 우리는 먼저 형광 현미경 검사법과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 tdTomato 발현을 정량화했습니다. 이것은 dd-PCR를 사용하여 주입된 망막에 있는 AAV 게놈의 정량화를 위한 게놈 DNA의 격리에 선행되었습니다. dd-PCR에 의해 정량화된 변환된 AAV 게놈과 tdTomato 발현 수준을 비교한 결과 dd-PCR 방법은 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 정확하게 정량화한 것으로 나타났다. 당사의 프로토콜은 AAV 변환 효율성을 정량화하기 위해 dd-PCR 기반 방법론에 대한 자세한 설명을 보여 주어. 이 프로토콜에서, 우리는 또한 단순히 게놈 DNA 격리 및 dd-PCR 결과 후에 희석 인자를 사용하여 인트라비티리얼 주사 후에 유도되는 AAV 게놈의 절대 수를 보여줍니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 망막에서 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율성을 정량화하기 위한 기자 표현의 대안이 될 강력한 방법을 제공한다.
이 프로토콜에서, 우리는 다른 capsid 단백질을 가진 2개의 AAV 벡터를 생성하고 그에 따라 그(것)들을 titered. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 변환12,13후에 감지 가능한 리포터 발현을 산출하는 충분한 양의 AAV를 생성하는 것입니다.
AAV의 Titering 또한 intravitreal 주사에 대 한 AAV의 복용량을 조정 하는 중요 한 요소. 이러한 중?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 Oezkan 켈레스, 조세핀 Jüttner, 교수 보톤드 로스카, 분자 및 임상 안과 바젤, AAV 생산에 대한 그들의 도움과 지원을위한 복잡한 바이러스 플랫폼에 감사드립니다. 우리는 또한 교수 장 베넷, 의학의 페렐만 학교, AAV8 / BP2 균주에 대한 펜실베니아 대학에게 감사드립니다. 동물 작업은 Gebze 기술 대학 동물 시설에서 수행됩니다. 이를 위해, 우리는 기술 지원과 축산에 대한 지원을 위해 라일라 디크메타스와 교수 Uygar Halis Tazebay 교수에게 감사드립니다. 우리는 또한 원고에 대한 그녀의 의견에 대한 박사 Fatma 오즈데미르에게 감사드립니다. 이 작품은 TUBITAK, 교부금 번호 118C226 및 121N275, 사반치 대학 통합 보조금에 의해 지원됩니다.
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
Isoflurane | ADEKA ![]() ![]() ![]() ![]() |
N01AB06 | anesthetic |
Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim ![]() ![]() |
S01FA06 | pupil dilation |
Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |