뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 지금 일반적으로 망막 유전자 치료 연구의 각종을 위해 이용됩니다. AAV는 면역genicity및 적은 게놈 통합을 가진 유전자 전달의 안전하고 효율적인 방법을 제공합니다. 표적 세포로의 AAV 진입은 세포 표면^1,2에수용체 및 공동 수용체의 결합을 요구하는 내분비증을 통해 발생합니다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 AAV의 변환 효율은 주로 캡시드 및 숙주 세포 수용체와의 상호 작용에 달려 있다. AAV는 혈청형을 가지고 있으며 각 혈청형은 뚜렷한 세포/조직 트로피즘과 전관 효율을 가질 수 있습니다. 또한 바이러스 캡시드의 화학적 변형, 하이브리드 캡시드 생산, 펩타이드 삽입, 캡시드 셔플, 지향진화, 합리적 돌연변이발생^3의화학적 변형에 의해 생성된 인공 AAV 혈청형 및 변이체도 있다. 아미노산 서열 또는 캡시드 구조의 사소한 변화조차도 숙주 세포 인자와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며 다른 트로피4를 초래할 수 있다. 캡시드 변이체 외에도, AAV 생산의 사출 경로 및 배치 간 변화와 같은 다른 요인은 신경 망막에서 AAV의 변환 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 다른 변종에 대한 변환 속도의 비교를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다.

AAV 트랜스듀션 효율을 결정하는 대부분의 방법은 리포터 유전자 발현에 의존한다. 이들은 리포터 유전자^생성물의형광 화상 진찰, 면역히스토케, 서양 얼룩, 또는 화학적 분석을^포함5,6,7. 그러나, AAV의 크기 제약으로 인해, 트랜스듀션 효율을 모니터링하기 위해 기자 유전자를 포함하는 것이 항상 가능하지는 않다. mRNA 안정기 서열로서 하이브리드 CMV 증강제/닭 베타-액틴 또는 우드척 형 간염 조절 원소(WPRE)와 같은 강력한 프로모터를 사용하면 크기 문제를 더욱 복잡하게 만든다^8. 따라서 보다 직접적인 방법론으로 주입된 AAV의 트랜스듀션 속도를 정의하는 것도 도움이 될 것이다.

디지털 물방울 PCR (dd-PCR)은 미세한 양의 샘플에서 표적 DNA를 정량화하는 강력한 기술입니다. dd-PCR 기술은 오일 방울에 의한 표적 DNA 및 PCR 반응 혼합물의 캡슐화에 의존한다. 각 dd-PCR 반응에는 수천 개의 물방울이 포함되어 있습니다. 각 액적은 독립적인 PCR 반응^9로처리되고 분석된다. 물방울의 분석은 푸아송 알고리즘을 사용하여 모든 샘플에서 표적 DNA 분자의 절대 복사 수를 계산할 수 있습니다. AAV의 트랜스듀션 효율은 뉴런 망막에서 AAV 게놈의 카피 수와 상관관계가 있기 때문에 DD-PCR 방법을 사용하여 AAV 게놈을 정량화했습니다.

여기서, 우리는 망막 게놈 DNA^{6,10로부터}AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 계산하기 위해 dd-PCR 방법론을 설명한다. 먼저, tdTomato 리포터를 표현하는 AAV는 소규모 프로토콜을 사용하여 생성되었고, dd-PCR^{방법(11)에}의해 적발되었다. 둘째, AAV는 신경 망막에 주입되었습니다. 트랜스듀션 효율을 입증하기 위해, 우리는 먼저 형광 현미경 검사법과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 tdTomato 발현을 정량화했습니다. 이것은 dd-PCR를 사용하여 주입된 망막에 있는 AAV 게놈의 정량화를 위한 게놈 DNA의 격리에 선행되었습니다. dd-PCR에 의해 정량화된 변환된 AAV 게놈과 tdTomato 발현 수준을 비교한 결과 dd-PCR 방법은 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 정확하게 정량화한 것으로 나타났다. 당사의 프로토콜은 AAV 변환 효율성을 정량화하기 위해 dd-PCR 기반 방법론에 대한 자세한 설명을 보여 주어. 이 프로토콜에서, 우리는 또한 단순히 게놈 DNA 격리 및 dd-PCR 결과 후에 희석 인자를 사용하여 인트라비티리얼 주사 후에 유도되는 AAV 게놈의 절대 수를 보여줍니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 망막에서 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율성을 정량화하기 위한 기자 표현의 대안이 될 강력한 방법을 제공한다.