Метод цифровой капельной ПЦР для количественной оценки эффективности трансдукции AAV в мышиной сетчатке
Summary
Этот протокол представляет, как количественно оценить эффективность трансдукции AAV в сетчатке мыши с использованием цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) вместе с мелкомасштабным производством AAV, интравитреальной инъекцией, визуализацией сетчатки и выделением геномной ДНК сетчатки.
Abstract
Многие лаборатории клеточной биологии сетчатки в настоящее время регулярно используют аденоассоциированные вирусы (AAV) для редактирования генов и регуляторных приложений. Эффективность трансдукции AAV обычно имеет решающее значение, что влияет на общие экспериментальные результаты. Одним из основных факторов, определяющих эффективность трансдукции, является серотип или вариант вектора AAV. В настоящее время доступны различные искусственные серотипы и варианты AAV с различным сродством к рецепторам клеточной поверхности хозяина. Для генной терапии сетчатки это приводит к различной степени эффективности трансдукции для различных типов клеток сетчатки. Кроме того, способ инъекции и качество производства AAV могут также влиять на эффективность трансдукции AAV сетчатки. Поэтому важно сравнивать эффективность различных вариантов, партий и методологий. Метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) с высокой точностью количественно определяет нуклеиновые кислоты и позволяет выполнять абсолютную количественную оценку заданной мишени без какого-либо стандарта или эталона. Используя dd-PCR, также возможно оценить эффективность трансдукции AAV путем абсолютной количественной оценки числа копий генома AAV в инъекционной сетчатке. Здесь мы предоставляем простой метод количественной оценки скорости трансдукции AAV в клетках сетчатки с использованием dd-PCR. С незначительными изменениями эта методология также может быть основой для количественной оценки числа копий митохондриальной ДНК, а также для оценки эффективности редактирования оснований, критически важного для нескольких заболеваний сетчатки и применения генной терапии.
Introduction
Аденоассоциированные вирусы (AAV) в настоящее время широко используются для различных исследований генной терапии сетчатки. AAV обеспечивают безопасный и эффективный способ доставки генов с меньшей иммуногенностью и меньшим количеством интеграций генома. Проникновение AAV в клетку-мишень происходит через эндоцитоз, который требует связывания рецепторов и корецепторов на поверхности клетки1,2. Поэтому эффективность трансдукции AAV для различных типов клеток зависит главным образом от капсида и его взаимодействия с рецепторами клетки-хозяина. AAV имеют серотипы, и каждый серотип может иметь различные клеточные / тканевые тропизмы и эффективность трансдукции. Существуют также искусственные серотипы и варианты AAV, генерируемые химической модификацией капсида вируса, производством гибридных капсидов, введением пептидов, перетасовкой капсидов, направленной эволюцией и рациональным мутагенезом3. Даже незначительные изменения в аминокислотной последовательности или структуре капсидов могут влиять на взаимодействие с факторами клетки-хозяина и приводить к различным тропизмам4. В дополнение к вариантам капсида, другие факторы, такие как маршрут инъекции и вариация производства AAV от партии к партии, могут влиять на эффективность трансдукции AAV в нейронной сетчатке. Поэтому необходимы надежные методы сравнения скоростей трансдукции для разных вариантов.
Большинство методов определения эффективности трансдукции AAV основаны на экспрессии репортерных генов. К ним относятся флуоресцентная визуализация, иммуногистохимия, вестерн-блот или гистохимический анализ репортерного генного продукта5,6,7. Однако из-за ограничения размера AAV не всегда возможно включить репортерные гены для мониторинга эффективности трансдукции. Использование сильных промоторов, таких как гибридный усилитель ЦМВ / куриный бета-актин или посттранскрипционный регуляторный элемент гепатита Вудчака (WPRE) в качестве последовательности стабилизатора мРНК, еще больше усложняет проблему размера8. Поэтому также будет полезно определить скорость трансдукции вводимых AAV с более прямой методологией.
Цифровая капельная ПЦР (dd-PCR) является мощным методом количественной оценки целевой ДНК из мельчайших количеств образцов. Технология dd-PCR зависит от инкапсуляции целевой ДНК и реакционной смеси ПЦР каплями масла. Каждая реакция dd-PCR содержит тысячи капель. Каждая капля обрабатывается и анализируется как независимаяреакция ПЦР 9. Анализ капель позволяет рассчитать абсолютное число копий молекул-мишеней ДНК в любом образце простым использованием алгоритма Пуассона. Поскольку эффективность трансдукции AAV коррелирует с числом копий геномов AAV в нейронной сетчатке, мы использовали метод dd-PCR для количественной оценки геномов AAV.
Здесь мы описываем методологию dd-PCR для расчета эффективности трансдукции векторов AAV из геномной ДНК сетчатки6,10. Во-первых, AAV, которые экспрессируют tdTomato reporter, были сгенерированы с использованием протокола малого масштаба и титрованы методом11dd-PCR. Во-вторых, AAV были интравитреально введены в нейронную сетчатку. Чтобы продемонстрировать эффективность трансдукции, мы сначала количественно оценили экспрессию tdTomato с помощью флуоресцентной микроскопии и программного обеспечения ImageJ. За этим последовала изоляция геномной ДНК для количественной оценки геномов AAV в инъекционных сетчатках с использованием dd-PCR. Сравнение уровней экспрессии tdTomato с трансдуцированными геномами AAV, количественно оцененными с помощью dd-PCR, показало, что метод dd-PCR точно количественно определил эффективность трансдукции векторов AAV. Наши протоколы продемонстрировали подробное описание методологии на основе dd-PCR для количественной оценки эффективности трансдукции AAV. В этом протоколе мы также показываем абсолютное количество геномов AAV, которые трансдуцируются после интравитреальных инъекций, просто используя фактор разбавления после выделения геномной ДНК и результатов dd-PCR. В целом, этот протокол обеспечивает мощный метод, который будет альтернативой репортерной экспрессии для количественной оценки эффективности трансдукции векторов AAV в сетчатке.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы сгенерировали два вектора AAV, которые имеют разные капсидные белки, а затем титровали их соответствующим образом. Одним из наиболее важных шагов этого протокола является получение достаточного количества AAV, которые дадут обнаруживаемую репортерную экспрессию посл…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Oezkan Keles, Josephine Jüttner и профессора Botond Roska, Институт молекулярной и клинической офтальмологии Базеля, Complex Viruss Platform за их помощь и поддержку в производстве AAV. Мы также хотели бы поблагодарить профессора Джин Беннетт, Медицинскую школу Перельмана, Университет Пенсильвании за штамм AAV8 / BP2. Работа с животными выполняется на животноводческом объекте Технического университета Гебзе. За это мы благодарим Лейлу Дикметас и профессора Уйгара Халиса Тазебая за техническую помощь и поддержку животноводства. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Фатьму Оздемир за ее комментарии к рукописи. Эта работа поддерживается TUBITAK, грантами No 118C226 и 121N275 и грантом sabanci University Integration.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referências
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).
