Méthode de PCR par gouttelettes numériques pour la quantification de l’efficacité de la transduction de l’AAV dans la rétine murine

Les virus associés à l’adéno (AAV) sont maintenant couramment utilisés pour diverses études de thérapie génique rétinienne. Les AAV offrent un moyen sûr et efficace d’administration de gènes avec moins d’immunogénicité et moins d’intégrations du génome. L’entrée de l’AAV dans la cellule cible se produit par endocytose, ce qui nécessite la liaison des récepteurs et des co-récepteurs à la surface de la cellule^1,2. Par conséquent, l’efficacité de transduction des AAV pour différents types de cellules dépend principalement de la capside et de ses interactions avec les récepteurs de la cellule hôte. Les AAV ont des sérotypes et chaque sérotype peut avoir des tropismes cellulaires / tissulaires distincts et des efficacités de transduction. Il existe également des sérotypes et des variantes artificiels de l’AAV générés par la modification chimique de la capside virale, la production de capsides hybrides, l’insertion peptidique, le brassage de la capside, l’évolution dirigée et la mutagénèse rationnelle³. Même des changements mineurs dans la séquence d’acides aminés ou la structure de la capside peuvent avoir une influence sur les interactions avec les facteurs de la cellule hôte et entraîner différents tropismes⁴. En plus des variantes de capside, d’autres facteurs tels que la voie d’injection et la variation de lot à lot de la production d’AAV peuvent affecter l’efficacité de transduction des AAV dans la rétine neuronale. Par conséquent, des méthodes fiables de comparaison des taux de transduction pour différentes variantes sont nécessaires.

La majorité des méthodes permettant de déterminer l’efficacité de la transduction de l’AAV reposent sur l’expression du gène rapporteur. Il s’agit notamment de l’imagerie fluorescente, de l’immunohistochimie, du transfert western ou de l’analyse histochimique du produit du gène rapporteur^5,6,7. Cependant, en raison de la contrainte de taille des AAV, il n’est pas toujours possible d’inclure des gènes rapporteurs pour surveiller l’efficacité de la transduction. L’utilisation de promoteurs puissants comme l’activateur hybride CMV/bêta-actine de poulet ou l’élément régulateur post-transcriptionnel de l’hépatite Woodchuck (WPRE) comme séquence stabilisatrice d’ARNm complique encore le problème de taille⁸. Par conséquent, il sera également avantageux de définir le taux de transduction des AAV injectés avec une méthodologie plus directe.

La PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) est une technique puissante pour quantifier l’ADN cible à partir de quantités infimes d’échantillons. La technologie dd-PCR dépend de l’encapsulation de l’ADN cible et du mélange réactionnel PCR par des gouttelettes d’huile. Chaque réaction dd-PCR contient des milliers de gouttelettes. Chaque gouttelette est traitée et analysée comme une réaction PCR indépendante⁹. L’analyse des gouttelettes permet de calculer le nombre absolu de copies des molécules d’ADN cibles dans n’importe quel échantillon en utilisant simplement l’algorithme de Poisson. Étant donné que l’efficacité de transduction des AAV est corrélée avec le nombre de copies des génomes AAV dans la rétine neuronale, nous avons utilisé la méthode dd-PCR pour quantifier les génomes AAV.

Ici, nous décrivons une méthodologie dd-PCR pour calculer l’efficacité de transduction des vecteurs AAV à partir de l’ADN^{génomique rétinien 6,10}. Tout d’abord, les AAV qui expriment tdTomato reporter ont été générés en utilisant le protocole à petite échelle, et titrés par la méthode dd-PCR¹¹. Deuxièmement, les AAV ont été injectés par voie intravitréenne dans la rétine neuronale. Pour démontrer l’efficacité de la transduction, nous avons d’abord quantifié l’expression de tdTomato à l’aide de la microscopie fluorescente et du logiciel ImageJ. Cela a été suivi par l’isolement de l’ADN génomique pour la quantification des génomes AAV dans les rétines injectées à l’aide de la dd-PCR. La comparaison des niveaux d’expression de tdTomato avec les génomes dAV transduilés quantifiés par la dd-PCR a montré que la méthode dd-PCR quantifiait avec précision l’efficacité de transduction des vecteurs AAV. Nos protocoles ont démontré une description détaillée d’une méthodologie basée sur la dd-PCR pour quantifier l’efficacité de la transduction de l’AAV. Dans ce protocole, nous montrons également le nombre absolu de génomes AAV qui sont transduis après des injections intravitréennes en utilisant simplement le facteur de dilution après l’isolement de l’ADN génomique et les résultats de la dd-PCR. Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode puissante, qui serait une alternative à l’expression rapporteure pour quantifier l’efficacité de la transduction des vecteurs AAV dans la rétine.