Ce protocole montre comment quantifier l’efficacité de la transduction de l’AAV dans la rétine de souris en utilisant la PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) ainsi que la production d’AAV à petite échelle, l’injection intravitréenne, l’imagerie rétinienne et l’isolement de l’ADN génomique rétinien.
De nombreux laboratoires de biologie cellulaire de la rétine utilisent maintenant régulièrement des virus associés à l’adéno (AAV) pour l’édition de gènes et des applications réglementaires. L’efficacité de la transduction de l’AAV est généralement critique, ce qui affecte les résultats expérimentaux globaux. L’un des principaux déterminants de l’efficacité de la transduction est le sérotype ou la variante du vecteur AAV. Actuellement, divers sérotypes et variantes artificiels de l’AAV sont disponibles avec différentes affinités pour les récepteurs de surface des cellules hôtes. Pour la thérapie génique rétinienne, il en résulte différents degrés d’efficacité de transduction pour différents types de cellules rétiniennes. En outre, la voie d’injection et la qualité de la production d’AAV peuvent également affecter l’efficacité de la transduction de l’AAV rétinien. Par conséquent, il est essentiel de comparer l’efficacité de différentes variantes, lots et méthodologies. La méthode de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) quantifie les acides nucléiques avec une grande précision et permet d’effectuer une quantification absolue d’une cible donnée sans étalon ni référence. En utilisant la dd-PCR, il est également possible d’évaluer l’efficacité de la transduction des AAV par quantification absolue du nombre de copies du génome AAV dans une rétine injectée. Ici, nous fournissons une méthode simple pour quantifier le taux de transduction des AAV dans les cellules rétiniennes en utilisant la dd-PCR. Avec des modifications mineures, cette méthodologie peut également servir de base à la quantification du nombre de copies de l’ADN mitochondrial ainsi qu’à l’évaluation de l’efficacité de l’édition de base, essentielle pour plusieurs maladies de la rétine et applications de thérapie génique.
Les virus associés à l’adéno (AAV) sont maintenant couramment utilisés pour diverses études de thérapie génique rétinienne. Les AAV offrent un moyen sûr et efficace d’administration de gènes avec moins d’immunogénicité et moins d’intégrations du génome. L’entrée de l’AAV dans la cellule cible se produit par endocytose, ce qui nécessite la liaison des récepteurs et des co-récepteurs à la surface de la cellule1,2. Par conséquent, l’efficacité de transduction des AAV pour différents types de cellules dépend principalement de la capside et de ses interactions avec les récepteurs de la cellule hôte. Les AAV ont des sérotypes et chaque sérotype peut avoir des tropismes cellulaires / tissulaires distincts et des efficacités de transduction. Il existe également des sérotypes et des variantes artificiels de l’AAV générés par la modification chimique de la capside virale, la production de capsides hybrides, l’insertion peptidique, le brassage de la capside, l’évolution dirigée et la mutagénèse rationnelle3. Même des changements mineurs dans la séquence d’acides aminés ou la structure de la capside peuvent avoir une influence sur les interactions avec les facteurs de la cellule hôte et entraîner différents tropismes4. En plus des variantes de capside, d’autres facteurs tels que la voie d’injection et la variation de lot à lot de la production d’AAV peuvent affecter l’efficacité de transduction des AAV dans la rétine neuronale. Par conséquent, des méthodes fiables de comparaison des taux de transduction pour différentes variantes sont nécessaires.
La majorité des méthodes permettant de déterminer l’efficacité de la transduction de l’AAV reposent sur l’expression du gène rapporteur. Il s’agit notamment de l’imagerie fluorescente, de l’immunohistochimie, du transfert western ou de l’analyse histochimique du produit du gène rapporteur5,6,7. Cependant, en raison de la contrainte de taille des AAV, il n’est pas toujours possible d’inclure des gènes rapporteurs pour surveiller l’efficacité de la transduction. L’utilisation de promoteurs puissants comme l’activateur hybride CMV/bêta-actine de poulet ou l’élément régulateur post-transcriptionnel de l’hépatite Woodchuck (WPRE) comme séquence stabilisatrice d’ARNm complique encore le problème de taille8. Par conséquent, il sera également avantageux de définir le taux de transduction des AAV injectés avec une méthodologie plus directe.
La PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) est une technique puissante pour quantifier l’ADN cible à partir de quantités infimes d’échantillons. La technologie dd-PCR dépend de l’encapsulation de l’ADN cible et du mélange réactionnel PCR par des gouttelettes d’huile. Chaque réaction dd-PCR contient des milliers de gouttelettes. Chaque gouttelette est traitée et analysée comme une réaction PCR indépendante9. L’analyse des gouttelettes permet de calculer le nombre absolu de copies des molécules d’ADN cibles dans n’importe quel échantillon en utilisant simplement l’algorithme de Poisson. Étant donné que l’efficacité de transduction des AAV est corrélée avec le nombre de copies des génomes AAV dans la rétine neuronale, nous avons utilisé la méthode dd-PCR pour quantifier les génomes AAV.
Ici, nous décrivons une méthodologie dd-PCR pour calculer l’efficacité de transduction des vecteurs AAV à partir de l’ADNgénomique rétinien 6,10. Tout d’abord, les AAV qui expriment tdTomato reporter ont été générés en utilisant le protocole à petite échelle, et titrés par la méthode dd-PCR11. Deuxièmement, les AAV ont été injectés par voie intravitréenne dans la rétine neuronale. Pour démontrer l’efficacité de la transduction, nous avons d’abord quantifié l’expression de tdTomato à l’aide de la microscopie fluorescente et du logiciel ImageJ. Cela a été suivi par l’isolement de l’ADN génomique pour la quantification des génomes AAV dans les rétines injectées à l’aide de la dd-PCR. La comparaison des niveaux d’expression de tdTomato avec les génomes dAV transduilés quantifiés par la dd-PCR a montré que la méthode dd-PCR quantifiait avec précision l’efficacité de transduction des vecteurs AAV. Nos protocoles ont démontré une description détaillée d’une méthodologie basée sur la dd-PCR pour quantifier l’efficacité de la transduction de l’AAV. Dans ce protocole, nous montrons également le nombre absolu de génomes AAV qui sont transduis après des injections intravitréennes en utilisant simplement le facteur de dilution après l’isolement de l’ADN génomique et les résultats de la dd-PCR. Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode puissante, qui serait une alternative à l’expression rapporteure pour quantifier l’efficacité de la transduction des vecteurs AAV dans la rétine.
Dans ce protocole, nous avons généré deux vecteurs AAV qui ont des protéines de capside différentes, puis nous les avons titrés en conséquence. L’une des étapes les plus cruciales de ce protocole est de produire des quantités suffisantes d’AAV qui produiront une expression de rapporteur détectable après la transduction12,13.
Le titrage des AAV est également un facteur important pour ajuster les doses d’AAV pour les…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Oezkan Keles, Josephine Jüttner et le professeur Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform pour leur aide et leur soutien à la production d’AAV. Nous tenons également à remercier le professeur Jean Bennett, de la Perelman School of Medicine de l’Université de Pennsylvanie, pour la souche AAV8/BP2. Le travail animal est effectué à l’installation pour animaux de l’Université technique de Gebze. Pour cela, nous remercions Leyla Dikmetas et le professeur Uygar Halis Tazebay pour leur assistance technique et leur soutien à l’élevage. Nous tenons également à remercier la Dre Fatma Ozdemir pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce travail est soutenu par TUBITAK, les subventions 118C226 et 121N275, et la subvention d’intégration de l’Université Sabanci.
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
Isoflurane | ADEKA ![]() ![]() ![]() ![]() |
N01AB06 | anesthetic |
Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim ![]() ![]() |
S01FA06 | pupil dilation |
Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |