Modellering av amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i laboratoriet er gjort unikt utfordrende på grunn av den overveldende sporadiske naturen til over 80% av ^tilfellene1, kombinert med det store antallet genetiske mutasjoner kjent for å være sykdomsfremkallende2. Til tross for dette deler alle tilfeller av ALS den samlende funksjonen at før direkte nevronal degenerasjon, er det dysfunksjonell kommunikasjon mellom presynaptiske motoriske nevroner og postsynaptiske ^{muskelceller3,4}. Klinisk, når pasienter mister tilkoblingen til de gjenværende øvre og nedre motoriske nevronene, presenterer de funksjoner av nevronal hyper- og hypoeksitabilitet gjennom hele ^{sykdommen5,6,7,8,9}, som reflekterer komplekse underliggende molekylære endringer i disse synapsene, som vi som ALS-forskere søker å forstå.

Flere transgene modeller har illustrert at forverring og uorganisering av det nevromuskulære krysset forekommer med uttrykk for ALS-forårsakende genetiske mutasjoner, inkludert ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 og TDP4317,18,19 gjennom morfologiske vurderinger, inkludert evaluering av synaptiske boutons, ryggtetthet og pre/postsynaptisk organisering. Mekanistisk, siden landemerkepapirene til Cole, Hodgkin og Huxley på 1930-tallet, har det også vært mulig å evaluere synaptiske responser gjennom elektrofysiologiske teknikker i enten in vitro cellekultur eller vevsskivepreparater20. Gjennom disse strategiene har mange modeller av ALS vist synaptiske overføringsunderskudd. For eksempel forårsaker en mutantvariant av TDP43 forbedret avfyringsfrekvens og reduserer handlingspotensialterskelen i NSC-34 (ryggmargen x nevroblastomhybridcellelinje 34) motor-neuron-lignende ^celler21. Den samme varianten forårsaker også dysfunksjonell synaptisk overføring ved det nevromuskulære krysset (NMJ) før utbruddet av atferdsmotoriske underskudd i en ^musemodell22. Det ble tidligere vist at mutant FUS-uttrykk resulterer i redusert synaptisk overføring ved NMJ i en drosophila-modell av FUS-ALS før lokomotoriske ^defekter11. En fersk rapport ved hjelp av induserte pluripotente stamceller avledet fra C9orf72-ekspansjonsbærere avslørte en reduksjon i det lett utleide bassenget med synaptiske ^vesikler23. Til sammen fremhever disse studiene og andre viktigheten av å bygge en mer omfattende forståelse av mekanismene som ligger til grunn for synaptisk signalering i sykdomsrelevante modeller av ALS. Dette vil være avgjørende for å forstå als patobiologi og utvikle potensielle terapeutiske mål for pasienter.

Metoder for strøm- og spenningsklemmeceller har vært uvurderlige for å bestemme membranegenskaper som ledning, hvilemembranpotensial og sløsing med individuelle synapser20,24. En av de betydelige begrensningene ved elektrofysiologi er imidlertid at den er teknisk utfordrende og bare gir innsikt fra en enkelt nevron om gangen. Live-celle konfokal mikroskopi, kombinert med spesifikke fluorescerende sonder, gir muligheten til å undersøke synaptisk overføring av nevroner på en romlig måte25,26,27. Selv om det ikke er et direkte mål på nevronal spenning, kan denne fluorescenstilnærmingen gi en relativ måling av to molekylære korrelasjoner av synaptisk funksjon: synaptisk vesiclefrigjøring og kalsiumtransienter ved synaptiske terminaler.

Når et handlingspotensial når den presynaptiske terminalregionen av nevroner, utløses kalsiumtransienter, noe som letter overgangen fra et elektrisk signal til prosessen med nevrotransmitterutløsning28. Spenningsporterte kalsiumkanaler lokalisert til disse områdene regulerer kalsiumsignalering tett for å modulere kinetikken til nevrotransmitterutløsning29. De første rapporterte fluorescensbaserte opptakene av kalsiumtransienter ble utført enten ved hjelp av dual-wavelength-indikatoren Fura-2 AM eller enkeltbølgelengdefargen Fluo-3 AM30,31,32. Selv om disse fargestoffene ga stor ny innsikt på den tiden, lider de av flere begrensninger som ikke-spesifikk oppdeling i celler, aktivt eller passivt fargetap fra merkede celler, fotobleaching og toksisitet hvis de er avbildet over lengre perioder ^{på tid33}. I løpet av det siste tiåret har genetisk kodede kalsiumindikatorer blitt arbeidshester for avbildning av ulike former for nevronaktivitet. Disse indikatorene kombinerer et modifisert fluorescerende protein med et kalsiumchelatorprotein som raskt bytter fluorescensintensitet etter bindingen av ^{Ca2 + ions34}. Anvendelsen av disse nye indikatorene er enorm, noe som gir mye enklere visualisering av intracellulære kalsiumtransienter både i in vitro– og in vivo-innstillinger. En familie av disse genetisk kodede reporterne, kjent som GCaMP, er nå bredt utnyttet. Disse indikatorene inneholder et C-terminal calmodulin-domene, etterfulgt av grønt fluorescerende protein (GFP), og er avkortet av en N-terminal calmodulin-bindende ^region35,36. Kalsiumbindende til calmodulin-domenet utløser en interaksjon med calmodulinbindingsområdet, noe som resulterer i en konformasjonsendring i den totale proteinstrukturen og en betydelig økning i fluorescensen til GFP-moiety35,36. Gjennom årene har denne familien av reportere gjennomgått flere evolusjoner for å muliggjøre tydelige avlesninger for bestemte kalsiumtransienter med spesifikke kinetikk (langsom, middels og rask), hver med litt forskjellige ^{egenskaper37,38}. Her har bruken av reporteren GcaMP6 blitt fremhevet, som tidligere har vist seg å oppdage enkelthandlingspotensialer og dendrittiske kalsiumtransienter i nevroner både in vivo og in vitro37.

Kalsiumtransienter i den presynaptiske regionen utløser synaptiske vesiclefusjonshendelser, forårsaker nevrotransmitterutløsning i synapse og initiering av signalhendelser i den postsynaptiske ^cellen28,39. Synaptiske vesicles frigjøres og resirkuleres både raskt og resirkuleres, da cellen homeostatically opprettholder et stabilt cellemembranoverflateområde og lett utgilig basseng med fusjonsdyktige membranbundne ^vesicles40. Styrylfargen som brukes her har en affinitet mot lipidmembraner og endrer spesielt utslippsegenskapene basert på bestilling av det omkringliggende ^{lipidmiljøet41,42}. Dermed er det et ideelt verktøy for merking av synaptiske vesikler og etterfølgende sporing av disse vesiklene når de senere slippes ut etter nevronal stimulering41,42. Protokollen som er generert og optimalisert er en tilpasning av konseptene beskrevet i utgangspunktet av Gaffield og kolleger, som lar oss visualisere styrylfargemerket synaptisk vesicle puncta over tid ^{kontinuerlig41}.

Her beskrives to relaterte fluorescensbaserte metoder, og rapporterer pålitelig spesifikke cellulære hendelser involvert i synaptisk overføring. Protokoller har blitt definert for å sondere dynamikken i depolariseringsmediert presynaptisk terminal kalsiumtilstrømning og synaptisk vesicle exocytose hos dyrkede nevroner. Her er metoder og representative resultater fokusert på å bruke primære gnagerkortikale eller motoriske nevroner som in vitro-modellsystem, da det er publiserte studier ved hjelp av disse ^{celletypene43,44}. Imidlertid gjelder disse metodene også for differensiert human ⁱ³ kortikale ^nevroner45, da vi også har hatt suksess med begge protokollene i dagens pågående eksperimentering i laboratoriet vårt. Den generelle protokollen er skissert i et trinnvis lineært format, vist i figur 1. Kort sagt, for å studere kalsiumdynamikk i nevritter, blir modne nevroner transfektert med plasmid DNA for å uttrykke fluorescerende reporter GCaMP6m under en Cytomegalovirus (CMV) ^{promotor37,46}. Transfekterte celler har et lavt nivå av basal grønn fluorescens, noe som øker i nærvær av kalsium. Interesseregioner er spesifisert for å overvåke fluorescensendringer gjennom hele manipulasjonen vår. Dette gjør det mulig å måle svært romlige og tidsmessig lokaliserte svingninger i kalsium som skal ^måles37,46. For evaluering av synaptisk vesiclefusjon og frigjøring, er modne nevroner lastet med styrylfarge innlemmet i synaptiske vesiclemembraner når de resirkuleres, reformeres og lastes på nytt med nevrotransmittere i presynaptiske celler41,42,43,47,48. De nåværende fargestoffene som brukes til dette formålet etikett synaptiske vesicles langs nevritter og brukes som proxy for disse regionene i live-imaging eksperimenter, som vist ved co-farging av styryl fargestoff og synaptotagmin av Kraszewski og ^kolleger49. Inkludert her er representative bilder av lignende farging som også er utført (figur 2A). Tidligere etterforskere har i stor grad brukt slike fargestoffer til å rapportere synaptisk vesicledynamikk ved det nevromuskulære krysset og hippocampale nevroner48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Ved å velge punkteringsregioner av fargebelastede vesikler og ved å overvåke reduksjoner i fluorescensintensitet etter vesicle-frigjøring, kan funksjonell synaptisk overføringskapasitet og tidsdynamikk for frigjøring studeres etter stimulering43. For begge metodene brukes et medium som inneholder en høy konsentrasjon av kaliumklorid for å depolarisere celler for å etterligne nevronaktivitet. Bildeparametere er spesifisert for å fange opp intervaller på under sekund som spenner over en baseline normalisering etterfulgt av vår stimuleringsfangstperiode. Fluorescensmålinger på hvert tidspunkt bestemmes, normaliseres til bakgrunnen og kvantifiseres over den eksperimentelle tidsperioden. Kalsiumtilstrømning mediert GCaMP6m fluorescensøkning eller effektiv synaptisk vesicle exocytosis styryl fargestofffrigjøring fluorescensreduksjon kan oppdages gjennom denne strategien. Detaljert metodisk oppsett og parametere for disse to protokollene og en diskusjon om deres fordeler og begrensninger er beskrevet nedenfor.

Figur 1: Visuell gjengivelse av generell generell protokollprosess. (1) Isolere og kultur primære gnager nevroner in vitro til valgt modningstidspunkt. (2) Introduser GCaMP DNA eller styrylfargestoff som reportere av synaptisk aktivitet. (3) Oppsett bildebehandling paradigme ved hjelp av live-imaging utstyrt konfekt mikroskop og tilhørende programvare. Start planlagt registreringsperiode. (4) Mens celler fortsatt gjennomgår live-image fangst, stimulere nevroner via høy KCl bad perfusjon. (5) Vurdere fluorescensintensitetsmålinger over tid for å måle kalsiumtransienter eller synaptisk vesiclefusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.