מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

מידול טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) במעבדה הופך למאתגר באופן ייחודי בשל האופי הלא סדיר באופן גורף של מעל 80% ^{מהמקרים1}, יחד עם המספר העצום של מוטציות גנטיות הידועות כסובטיביות ^למחלה2. למרות זאת, כל המקרים של ALS חולקים את התכונה המאחדת שלפני ניוון עצבי גלוי, יש תקשורת לא מתפקדת בין נוירונים מוטוריים presynaptic ותאי שריר פוסט-סינפטיים3,4. מבחינה קלינית, כאשר חולים מאבדים את הקישוריות של הנוירונים המוטוריים העליונים והתחתונים הנותרים, הם מציגים תכונות של היפר-רגישות עצבית והיבועות לאורך המחלה ^5,6,7,8,9, המשקפים שינויים מולקולריים מורכבים בסיסיים בסינפסות אלה, שאנו, כחוקרי ALS, מבקשים להבין.

מודלים מהונדסים מרובים המחישו כי הידרדרות וחוסר ארגון של הצומת הנוירו-שרירי מתרחשים עם הביטוי של מוטציות גנטיות סיבתיות ALS, כולל ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16, ו- TDP4317,18,19 באמצעות הערכות מורפולוגיות, כולל הערכה של זרי פרחים סינפטיים, צפיפות עמוד שדרה, וארגון טרום/פוסט-סינפטי. מבחינה מכאניסטית, מאז ניירות ציון הדרך של קול, הודג’קין, האקסלי בשנות ה -30, ניתן היה גם להעריך תגובות סינפטיות באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות בתרבית תאים במבחנה או בהכנות פרוסת ^רקמות20. באמצעות אסטרטגיות אלה, מודלים רבים של ALS הוכיחו ליקויי שידור סינפטיים. לדוגמה, גרסה מוטנטית של TDP43 גורמת לתדירות ירי משופרת ומפחיתה את סף פוטנציאל הפעולה ב- NSC-34 (חוט השדרה x קו תאים היברידי נוירובלסטומה 34) תאים דמויי נוירון ^מנוע21. אותה גרסה גורמת גם להעברת סינפטית לא מתפקדת בצומת הנוירו-שרירית (NMJ) לפני הופעת ליקויים מוטוריים התנהגותיים במודל ^עכבר22. בעבר הוכח כי ביטוי FUS מוטנטי גורם שידור סינפטי מופחת ב NMJ במודל drosophila של FUS-ALS לפני פגמים ^locomotor11. דו”ח שנערך לאחרונה באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה נגזר נשאי התרחבות C9orf72 חשף ירידה במאגר לשחרור בקלות של שלפוחיות ^{סינפטי23}. בסך הכל, מחקרים אלה ואחרים מדגישים את החשיבות של בניית הבנה מקיפה יותר של המנגנונים שבבסיס האיתות הסינפטי במודלים רלוונטיים למחלות של ALS. זה יהיה מרכזי בהבנת הפתוביולוגיה של ALS ופיתוח יעדים טיפוליים פוטנציאליים עבור חולים.

שיטות של תאי הידוק זרם ומתח היו לא יסולא בפז בקביעת תכונות הממברנה כגון מוליכות, פוטנציאל ממברנה מנוחה, ותוכן קוונטי של סינפסות ^{בודדות20,24}. עם זאת, אחת המגבלות המשמעותיות של אלקטרופיזיולוגיה היא שזה מאתגר מבחינה טכנית ומספק רק תובנות מתא עצב יחיד בכל פעם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים, יחד עם בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, מציעה את ההזדמנות לחקור את ההעברה הסינפטית של נוירונים באופן מרחבי25,26,27. אמנם לא מידה ישירה של עירור עצבי, גישה פלואורסצנטית זו יכולה לספק מדידה יחסית של שני קורלציות מולקולריות של תפקוד סינפטי: שחרור שלפוחית סינפטית וחולפים סידן במסופים סינפטיים.

כאשר פוטנציאל פעולה מגיע לאזור המסוף presynaptic של נוירונים, ארעי סידן מופעלים, להקל על המעבר מאות חשמלי לתהליך של שחרור נוירוטרנסמיטר28. תעלות סידן מגודרות מתח מקומי לאזורים אלה לווסת היטב את איתות הסידן כדי לווסת את הקינטיקה של שחרור נוירוטרנסמיטר29. ההקלטות הראשונות המבוססות על פלואורסצנטיות של ארעי סידן בוצעו באמצעות מחוון אורך גל כפול Fura-2 AM או צבע אורך גל יחיד Fluo-3 AM30,31,32^. בעוד צבעים אלה הציעו תובנה חדשה נהדרת באותו זמן, הם סובלים ממספר מגבלות כגון מידור לא ספציפי בתוך תאים, אובדן צבע פעיל או פסיבי מתאים מסומנים, הלבנת פוטוגר ורעילות אם הם מצולמים על פני פרקי זמן ממושכים ^{של זמן33}. בעשור האחרון, אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית הפכו סוסי העבודה להדמיית צורות שונות של פעילות עצבית. אינדיקטורים אלה משלבים חלבון פלואורסצנטי שונה עם חלבון כלאטור סידן המחליף במהירות את עוצמת הפלואורסצנטיות לאחר הכריכה של ^{Ca2 +} יונים ³⁴. היישום של אינדיקטורים חדשים אלה הוא עצום, המאפשר הדמיה הרבה יותר קלה של ארעי סידן תאיים הן במבחנה והן בהגדרות vivo. משפחה אחת של כתבים מקודדים גנטית אלה, המכונה GCaMP, נמצאים כעת בשימוש נרחב. אינדיקטורים אלה מכילים תחום קלומודולין C-מסוף, ואחריו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), והם מכוסים על ידי אזור מחייב N-מסוף calmodulin35,36. סידן מחייב לתחום calmodulin מפעיל אינטראקציה עם האזור מחייב calmodulin, וכתוצאה מכך שינוי קונפורמציה במבנה החלבון הכולל ועלייה משמעותית פלואורסצנטיות של moiety ^{GFP 35,36}. במהלך השנים, משפחה זו של כתבים עברה מספר התפתחויות כדי לאפשר קריאות ברורות עבור ארעי סידן מסוימים עם קינטיקה ספציפית (איטי, בינוני ומהיר), כל אחד עם תכונות שונות ^{במקצת37,38}. כאן, השימוש של הכתב GcaMP6 הודגש, אשר הוכח בעבר לזהות פוטנציאל פעולה יחיד ו ארעי סידן דנדריטי בנוירונים הן ויוו והן במבחנה37.

סידן ארעי באזור presynaptic לעורר אירועי היתוך שלפוחית סינפטי, גרימת שחרור נוירוטרנסמיטר לתוך הסינפרסה וייזום של אירועי איתות בתא postsynaptic ^28,39. שלפוחיות סינפטיות משתחררות וממומחזרות במהירות, שכן התא שומר באופן הומיוסטאטי על שטח פנים יציב של קרום התא ובריכה הניתנת לשחרור בקלות של שלפוחיות בעלות יכולת היתוך הכרוכות ^{בממברנה40}. צבע סטיירל המשמש כאן יש זיקה כלפי קרום השומנים, במיוחד משנה את תכונות הפליטה שלה בהתבסס על ההזמנה של סביבת השומנים ^{שמסביב41,42}. לכן, זהו כלי אידיאלי עבור תיוג שלפוחיות סינפטיות מיחזור ומעקב אחר המעקב הבא של שלפוחיות אלה כפי שהם שוחררו מאוחר יותר בעקבות גירוי ^{עצבי41,42}. הפרוטוקול שנוצר ואופטימיזציה הוא הסתגלות של המושגים שתוארו בתחילה על ידי גפילד ועמיתיו, המאפשר לנו לדמיין styryl צבע מסומן שלפוחית סינפטית puncta לאורך זמן ^{ברציפות41}.

כאן מתוארות שתי מתודולוגיות מבוססות פלואורסצנטיות קשורות, המדווחות באופן אמין על אירועים תאיים ספציפיים המעורבים בשידור סינפטי. פרוטוקולים הוגדרו כדי לחקור את הדינמיקה של זרם סידן מסוף presynaptic בתיווך דה-פולאריזציה ואקסוציטוזיס שלפוחית סינפטית בתאי עצב מתורבתים. כאן, שיטות ותוצאות מייצגות מתמקדות בשימוש במכרסמים ראשוניים קליפת המוח או נוירונים מוטוריים כמערכת מודל הפריה חוץ גופית, שכן ישנם מחקרים שפורסמו באמצעות סוגי תאים ^אלה43,44. עם זאת, שיטות אלה חלות גם על נוירונים אנושיים מובחנים דמויי קליפת המוח ⁱ³⁴⁵, שכן יש לנו גם הצלחה עם שני הפרוטוקולים בניסויים המתמשכים כיום במעבדה שלנו. הפרוטוקול הכללי מתואר בתבנית ליניארית צעדית, המוצגת באיור 1. בקצרה, כדי לחקור את דינמיקת הסידן בנוריטים, נוירונים בוגרים מועברים עם DNA פלסמיד כדי לבטא את הכתב הפלואורסצנטי GCaMP6m תחת מקדם Cytomegalovirus (CMV) ^37,46. תאים שעברו זיהום יש רמה נמוכה של פלואורסצנטיות ירוקה בסיסית, אשר מגביר בנוכחות סידן. אזורי עניין מפורטים כדי לפקח על שינויים פלואורסצנטיים לאורך המניפולציה שלנו. זה מאפשר תנודות מקומיות מאוד מרחבית וזמן בסידן להימדד ^37,46. להערכת היתוך ושחרור שלפוחית סינפטית, נוירונים בוגרים עמוסים בצבע סטיירל המשולב בממברנות שלפוחית סינפטית כפי שהם ממוחזרים, רפורמה, ונטען מחדש עם נוירוטרנסמיטורים בתאים presynaptic41,42,43,43,47,48. הצבעים הנוכחיים המשמשים למטרה זו תווית שלפוחיות סינפטיות לאורך neurites ומשמשים פרוקסי עבור אזורים אלה בניסויים הדמיה חיה, כפי שמוצג על ידי הכתמה משותפת של צבע סטיירל ו synaptotagmin על ידי Kraszewski ^{ועמיתים49}. להלן תמונות מייצגות של כתמים דומים שבוצעו גם הם (איור 2A). חוקרים קודמים השתמשו בהרחבה בצבעים כאלה כדי לדווח על דינמיקת שלפוחית סינפטית בצומת neuromuscular ו נוירונים ההיפוקמפוס48,49,50,51,52,53,54,55,56 . על ידי בחירת אזורים דקדקאטים של שלפוחיות טעונות צבע ועל ידי ניטור ירידות בעוצמת הפלואורסצנטיות לאחר שחרור שלפוחית, ניתן ללמוד את יכולת ההולכה הסינפטית התפקודית ואת הדינמיקה הזמנית של שחרור לאחר ^גירוי43. עבור שתי השיטות, מדיום המכיל ריכוז גבוה של אשלגן כלורי משמש כדי depolarize תאים כדי לחקות את הפעילות העצבית. פרמטרי הדמיה מצוינים כדי ללכוד מרווחי זמן תת-שניים המשתרעים על פני נורמליזציה בסיסית ואחריה תקופת לכידת הגירוי שלנו. מדידות פלואורסצנטיות בכל נקודת זמן נקבעות, מנורמלות לרקע ומכומתות לאורך פרק הזמן הניסיוני. סידן-זרם מתווך GCaMP6m פלואורסצנטי להגדיל או יעיל אקסוציטוזיס שלפוחית סינפטית styocytosis styryl צבע לשחרר ירידה פלואורסצנטית ניתן לזהות באמצעות אסטרטגיה זו. התקנה מתודולוגית מפורטת ופרמטרים עבור שני פרוטוקולים אלה ודיון על היתרונות והמגבלות שלהם מתוארים להלן.

איור 1: עיבוד חזותי של תהליך הפרוטוקול הכללי הכולל. (1) לבודד ותרבות נוירונים מכרסמים ראשוניים במבחנה לנקודת זמן התבגרות שנבחרה. (2) להציג GCaMP DNA או צבע סטיירל ככתבים של פעילות סינפטית. (3) הגדרת פרדיגמת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בהדמיה חיה ותוכנות משויכות. התחל תקופת הקלטה בסיסית. (4) בעוד תאים עדיין עוברים לכידת תמונה חיה, לעורר נוירונים באמצעות זלוף אמבט KCl גבוה. (5) להעריך מדידות עוצמת פלואורסצנטיות לאורך זמן כדי למדוד סידן ארעי או היתוך שלפוחית סינפטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.