Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Laboratuvarda amiyotrofik lateral sklerozun (ALS) modellenmesi, vakaların %80’inden ^{fazlasının1} ezici bir şekilde sporadik doğası ve hastalığa bağlı olduğu bilinen çok sayıda genetik mutasyon ^nedeniyle2 benzersiz bir şekilde zorlaştırılmıştır. Buna rağmen, tüm ALS vakaları, doğrudan nöronal dejenerasyondan önce, presinaptik motor nöronlar ve postsinaptik kas hücreleri arasında işlevsiz bir iletişim olduğu birleştirici özelliği ^{paylaşır3,4}. Klinik olarak, hastalar kalan üst ve alt motor nöronların bağlantılarını kaybettikçe, hastalık boyunca nöronal hiper ve hipoeksitabilite özellikleri ile ortaya çıkarlar5,6,7,8,9^, ALS araştırmacıları olarak anlamaya çalıştığımız bu sinapslardaki karmaşık altta yatan moleküler değişiklikleri yansıtırlar.

Çoklu transgenik modeller, nöromüsküler kavşağın bozulmasının ve düzensizliğinin, SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 ve ^{TDP4317,18,19} dahil olmak üzere ALS-nedensel genetik mutasyonların ekspresyonuyla meydana geldiğini göstermiştir. sinaptik butonların, omurga yoğunluklarının ve sinaptik öncesi / sonrası organizasyonun değerlendirilmesi de dahil olmak üzere morfolojik değerlendirmeler yoluyla. Mekanik olarak, 1930’larda Cole, Hodgkin ve Huxley’nin dönüm noktası niteliğindeki makalelerinden bu yana, in vitro hücre kültüründe veya doku dilimi preparatlarında elektrofizyolojik tekniklerle sinaptik yanıtları değerlendirmek de mümkün ^olmuştur20. Bu stratejiler sayesinde, birçok ALS modeli sinaptik iletim açıklarını göstermiştir. Örneğin, TDP43’ün mutant bir varyantı, NSC-34 (omurilik x nöroblastom hibrid hücre hattı 34) motor nöron benzeri hücrelerde gelişmiş ateşleme sıklığına neden olur ve aksiyon potansiyeli eşiğini ^azaltır21. Aynı varyant aynı zamanda bir fare modelinde davranışsal motor eksikliklerin başlamasından önce nöromüsküler kavşakta (NMJ) işlevsiz sinaptik iletime neden ^olur22. Daha önce, mutant FUS ekspresyonunun, lokomotor kusurlardan önce FUS-ALS’nin drosophila modelinde NMJ’de sinaptik iletimin azalmasına neden olduğu ^{gösterilmiştir11}. C9orf72 genleşme taşıyıcılarından türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kullanıldığı yeni bir rapor, kolayca devredilebilen sinaptik vezikül havuzunda bir azalma olduğunu ortaya ^koymuştur23. Toplamda, bu çalışmalar ve diğerleri, ALS’nin hastalıkla ilgili modellerinde sinaptik sinyallemenin altında yatan mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasının önemini vurgulamaktadır. Bu, ALS’nin patobiyolojisini anlamada ve hastalar için potansiyel terapötik hedefler geliştirmede çok önemli olacaktır.

Akım ve gerilim sıkıştırma hücreleri yöntemleri, iletkenlik, dinlenme membranı potansiyeli ve bireysel sinapsların kantial içeriği gibi membran özelliklerinin belirlenmesinde paha biçilmez ^{olmuştur20,24}. Bununla birlikte, elektrofizyolojinin önemli sınırlamalarından biri, teknik olarak zor olması ve bir seferde yalnızca tek bir nörondan içgörü sağlamasıdır. Canlı hücre konfokal mikroskopisi, spesifik floresan problarla birleştiğinde, nöronların sinaptik iletimini mekansal zamansal bir şekilde araştırma fırsatı sunar25,26,27. Nöronal uyarılabilirliğin doğrudan bir ölçüsü olmasa da, bu floresan yaklaşımı, sinaptik fonksiyonun iki moleküler korelasyonunun göreceli bir ölçümünü sağlayabilir: sinaptik vezikül salınımı ve sinaptik terminallerde kalsiyum geçicileri.

Bir aksiyon potansiyeli nöronların presinaptik terminal bölgesine ulaştığında, kalsiyum geçicileri tetiklenir ve bir elektrik sinyalinden nörotransmitter salınım sürecine geçişi ^{kolaylaştırır28}. Bu alanlara lokalize olan voltaj kapılı kalsiyum kanalları, nörotransmitter salınımının kinetiğini modüle etmek için kalsiyum sinyalini sıkı bir şekilde ^düzenler29. Kalsiyum geçicilerinin ilk bildirilen floresan bazlı kayıtları, çift dalga boyu göstergesi Fura-2 veya tek dalga boyu boyası Fluo-3 ^AM30,31,32 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu boyalar o zamanlar harika yeni bilgiler sunarken, hücreler içinde spesifik olmayan bölümlere ayırma, etiketli hücrelerden aktif veya pasif boya kaybı, fotobeyazlatma ve uzun süre boyunca görüntülendiğinde toksisite gibi çeşitli sınırlamalardan ^{muzdariptirler33}. Son on yılda, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, çeşitli nöronal aktivite formlarını görüntülemek için iş gücü haline gelmiştir. Bu göstergeler, modifiye edilmiş bir floresan proteinini, ^Ca2+ iyonlarının bağlanmasından sonra floresan yoğunluğunu hızla değiştiren bir kalsiyum şelatör proteini ile ^{birleştirir34}. Bu yeni göstergelerin uygulanması çok geniştir ve hücre içi kalsiyum geçicilerinin hem in vitro hem de in vivo ortamlarda çok daha kolay görselleştirilmesini sağlar. GCaMP olarak bilinen bu genetik olarak kodlanmış muhabirlerin bir ailesi şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu göstergeler bir C-terminal kalmodülin alanı, ardından yeşil floresan proteini (GFP) içerir ve bir N-terminal kalmodülin bağlama bölgesi ^{ile sınırlıdır35,36}. Kalmodülin alanına kalsiyum bağlanması, kalmodulin bağlanma bölgesi ile bir etkileşimi tetikler, bu da genel protein yapısında konformasyonel bir değişikliğe ve GFP ^{moiety35,36’nın} floresansında önemli bir artışa neden olur. Yıllar geçtikçe, bu muhabir ailesi, her biri biraz farklı özelliklere sahip olan spesifik kinetiklere (yavaş, orta ve hızlı) sahip belirli kalsiyum geçicileri için farklı okumalar sağlamak için çeşitli evrimler ^{geçirmiştir37,38}. Burada, daha önce nöronlarda hem in vivo hem de in vitro37’de tek aksiyon potansiyellerini ve dendritik kalsiyum geçicilerini tespit ettiği gösterilen muhabir GcaMP6’nın kullanımı vurgulanmıştır.

Presinaptik bölgedeki kalsiyum geçicileri sinaptik vezikül füzyon olaylarını tetikleyerek sinapsa nörotransmitter salınımına ve postsinaptik hücrede sinyal olaylarının başlamasına neden ^olur28,39. Sinaptik veziküller hem hızlı bir şekilde salınır hem de geri dönüştürülür, çünkü hücre homeostatik olarak stabil bir hücre zarı yüzey alanını ve füzyon yeteneğine sahip membrana bağlı veziküllerin kolayca kirlenebilir havuzunu ^korur40. Burada kullanılan stiril boya, lipit membranlarına karşı bir afiniteye sahiptir ve özellikle çevredeki lipit ortamının sırasına bağlı olarak emisyon özelliklerini ^{değiştirir41,42}. Bu nedenle, geri dönüşüm sinaptik veziküllerinin etiketlenmesi ve daha sonra nöronal stimülasyonun ardından serbest bırakıldıkları için bu veziküllerin izlenmesi için ideal bir ^{araçtır41,42}. Oluşturulan ve optimize edilen protokol, başlangıçta Gaffield ve meslektaşları tarafından açıklanan kavramların bir uyarlamasıdır ve bu da zaman içinde sürekli olarak stiril boya etiketli sinaptik vezikül punktasını görselleştirmemizi ^sağlar41.

Burada, sinaptik iletimde yer alan spesifik hücresel olayları güvenilir bir şekilde bildiren iki ilgili floresan tabanlı metodoloji tanımlanmıştır. Kültürlü nöronlarda depolarizasyon aracılı presinaptik terminal kalsiyum inakımı ve sinaptik vezikül ekzositozunun dinamiklerini araştırmak için protokoller tanımlanmıştır. Burada, yöntemler ve temsili sonuçlar, primer kemirgen kortikal veya motor nöronların in vitro model sistemi olarak kullanılmasına odaklanmıştır, çünkü bu hücre tiplerini kullanan yayınlanmış çalışmalar ^vardır43,44. Bununla birlikte, bu yöntemler farklılaşmış insan ⁱ³ kortikal benzeri nöronlar için de ^{geçerlidir45}, çünkü laboratuvarımızda halen devam eden deneylerde her iki protokolle de başarı elde ettik. Genel protokol, Şekil 1’de gösterilen kademeli doğrusal bir biçimde özetlenmiştir. Kısacası, nöritlerde kalsiyum dinamiklerini incelemek için, olgun nöronlar, floresan muhabir GCaMP6m’yi bir Sitomegalovirüs (CMV) promotörü37,46 altında eksprese etmek için plazmid ^DNA’sı ile transfekte edilir. Transfekte hücreler, kalsiyum varlığında artan düşük bir bazal yeşil floresan seviyesine sahiptir. İlgilenilen bölgeler, manipülasyonumuz boyunca floresan değişikliklerini izlemek için belirtilmiştir. Bu, kalsiyumdaki yüksek uzamsal ve geçici olarak lokalize dalgalanmaların ölçülmesini ^sağlar37,46. Sinaptik vezikül füzyonunu ve salınımını değerlendirmek için, olgun nöronlar, presinaptik hücrelerdeki nörotransmiterlerle geri dönüştürüldükleri, reforme edildikleri ve yeniden yüklendikleri için sinaptik vezikül zarlarına dahil edilen stiril boya ile yüklenir41,42,43,47,48. Bu amaçla kullanılan mevcut boyalar, nöritler boyunca sinaptik vezikülleri etiketlemektedir ve Kraszewski ve meslektaşları tarafından stiril boya ve sinaptotagminin birlikte boyanmasıyla gösterildiği gibi, canlı görüntüleme deneylerinde bu bölgeler için bir vekil olarak ^{kullanılmaktadır49}. Burada, benzer boyama işleminin de gerçekleştirilmiş temsili görüntüleri yer almaktadır (Şekil 2A). Önceki araştırmacılar, nöromüsküler kavşaktaki sinaptik vezikül dinamiklerini ve hipokampal nöronları48,49,50,51,52,53,54,55,56’yı bildirmek için bu tür boyaları yaygın olarak kullanmışlardır. . Boya yüklü veziküllerin noktalama bölgelerini seçerek ve vezikül salınımını takiben floresan yoğunluğundaki düşüşleri izleyerek, fonksiyonel sinaptik iletim kapasitesi ve salınımın zamansal dinamikleri stimülasyonu takiben ^{incelenebilir43}. Her iki yöntem için, nöronal aktiviteyi taklit etmek için hücreleri depolarize etmek için yüksek konsantrasyonda potasyum klorür içeren bir ortam kullanılır. Görüntüleme parametreleri, bir temel normalizasyonu ve ardından stimülasyon yakalama süremizi kapsayan saniyenin altındaki aralıkları yakalamak için belirtilir. Her zaman noktasındaki floresan ölçümleri belirlenir, arka plana normalleştirilir ve deneysel zaman periyodu boyunca nicelleştirilir. Kalsiyum akışı aracılı GCaMP6m floresan artışı veya etkili sinaptik vezikül ekzositozu stiril boya salınımlı floresan azalması bu strateji ile tespit edilebilir. Bu iki protokol için ayrıntılı metodolojik kurulum ve parametreler ile avantajları ve sınırlamaları hakkında bir tartışma aşağıda açıklanmıştır.

Şekil 1: Genel genel protokol sürecinin görsel olarak işlenmesi. (1) Birincil kemirgen nöronlarını in vitro olarak seçilen olgunlaşma zaman noktasına izole edin ve kültürleyin. (2) GCaMP DNA veya stiril boyasını sinaptik aktivitenin muhabirleri olarak tanıtın. (3) Canlı görüntüleme donanımlı konfokal mikroskop ve ilgili yazılımları kullanarak görüntüleme paradigmasını kurmak. Temel kayıt dönemine başlayın. (4) Hücreler hala canlı görüntü yakalama sürecindeyken, yüksek KCl banyo perfüzyonu yoluyla nöronları uyarın. (5) Kalsiyum geçicilerini veya sinaptik vezikül füzyonunu ölçmek için zaman içindeki floresan yoğunluğu ölçümlerini değerlendirin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.