근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

실험실에서 근위축성 측삭경화증(ALS)을 모델링하는 것은 80% 이상의 사례¹의 압도적으로 산발적인 특성으로 인해 질병 원인으로 알려진 방대한 수의 유전 돌연변이와 결합되어 독특하게 도전적으로 이루어집니다². 그럼에도 불구하고, ALS의 모든 사례는 철저한 신경 변성 전에 시냅스 전 운동 뉴런과 시냅스 후 근육 세포 사이에 기능 장애 통신이 있다는 통일 된 특징^{을 공유합니다3,4}. 임 상적으로, 환자들이 남아있는 상부 및 하부 운동 뉴런의 연결성을 상실함에 따라, 그들은 질병 전반에 걸쳐 뉴런 하이퍼 및 저흥분성의 특징을 가지고 있습니다.5,6,7,8,9^, ALS 연구원으로서 우리가 이해하고자하는 이러한 시냅스에 대한 복잡한 기본 분자 변화를 반영합니다.

다중 트랜스제닉 모델은 SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 및 TDP4317,18,19를 포함하는 ALS 원인 유전자 돌연변이의 발현과 함께 신경근 접합부의 악화 및 해체가 발생한다는 것을 예시하였다. 시냅스 부톤, 척추 밀도 및 시냅스 전/후 조직의 평가를 포함한 형태학적 평가를 통해. 기계론적으로, 1930년대 콜, 호지킨, 헉슬리의 획기적인 논문 이후, 시험관내 세포 배양 또는 조직 슬라이스 제제²⁰에서 전기생리학적 기술을 통해 시냅스 반응을 평가하는 것도 가능해졌다. 이러한 전략을 통해 ALS의 많은 모델은 시냅스 전달 결핍을 입증했습니다. 예를 들어, TDP43의 돌연변이 변이체는 향상된 발사 주파수를 야기하고 NSC-34 (척수 x 신경모세포종 하이브리드 세포주 34) 전동-뉴런-유사 세포²¹에서 작용 전위 역치를 감소시킨다. 이 동일한 변이체는 또한 마우스 모델에서 행동 운동 결핍이 발병하기 전에 신경근 접합부 (NMJ)에서 기능 장애 시냅스 전달^{을 일으킨다22}. 이전에 FUS 발현 돌연변이체가 운동 결함 전에 FUS-ALS의 초파리 모델에서 NMJ에서 감소된 시냅스 전달을 초래한다는 것을 보여주었다¹¹. C9orf72-확장 담체로부터 유래된 유도된 만능 줄기 세포를 사용한 최근의 보고는 시냅스 소포의 쉽게 분리가능한 풀의 감소를 밝혀냈다²³. 전체적으로, 이러한 연구와 다른 연구들은 ALS의 질병 관련 모델에서 시냅스 신호전달의 기초가 되는 메커니즘에 대한 보다 포괄적인 이해를 구축하는 것의 중요성을 강조한다. 이것은 ALS의 병리학을 이해하고 환자를위한 잠재적 인 치료 목표를 개발하는 데 중추적 인 역할을 할 것입니다.

전류 및 전압 클램핑 셀의 방법은 컨덕턴스, 휴지 막 전위 및 개별 시냅스의 양자 함량과 같은 멤브레인 특성을 결정하는 데 매우 ^{중요합니다20,24}. 그러나 전기 생리학의 중요한 한계 중 하나는 기술적으로 도전적이며 한 번에 하나의 뉴런에서만 통찰력을 제공한다는 것입니다. 특정 형광 프로브와 결합 된 살아있는 세포 공초점 현미경 검사는 시공간 방식으로 뉴런의 시냅스 전달을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다^.25,26,27. 신경 흥분성의 직접적인 측정은 아니지만,이 형광 접근법은 시냅스 기능의 두 분자 상관 관계, 즉 시냅스 소포 방출과 시냅스 말단에서의 칼슘 과도 상태의 상대적 측정을 제공 할 수 있습니다.

작용 전위가 뉴런의 시냅스 전 말단 영역에 도달하면, 칼슘 과도 상태가 트리거되어 전기 신호에서 신경 전달 물질 방출 과정으로의 전환을 촉진합니다²⁸. 이 영역에 국한된 전압 게이트 칼슘 채널은 칼슘 신호 전달을 엄격하게 조절하여 신경 전달 물질 방출의 동역학을 조절합니다²⁹. 칼슘 과도 물질의 첫 번째보고 된 형광 기반 기록은 이중 파장 표시기 Fura-2 AM 또는 단일 파장 염료 Fluo-3 ^AM30,31,32를 사용하여 수행되었습니다. 이러한 염료는 당시에 큰 새로운 통찰력을 제공했지만, 세포 내 비특이적 구획화, 표지 된 세포로부터의 활성 또는 수동 염료 손실, 광표백 및 장기간에 걸쳐 이미징 된 경우 독성과 같은 몇 가지 한계로 고통 받고 있습니다³³. 지난 수십 년 동안 유전적으로 인코딩 된 칼슘 지표는 다양한 형태의 신경 활동을 이미징하는 데 효과적이었습니다. 이 지표는 변형된 형광 단백질과 칼슘 킬레이터 단백질을 결합하여 ^Ca2+ 이온³⁴의 결합 후 형광 강도를 빠르게 전환합니다. 이러한 새로운 지표의 적용은 광대하며, 시험관내 및 생체내 설정 모두에서 세포 내 칼슘 과도 상태를 훨씬 쉽게 시각화할 수 있습니다. GCaMP로 알려진 이러한 유전적으로 인코딩 된 기자의 한 가족은 현재 광범위하게 활용되고 있습니다. 이들 지표는 C 말단 칼모듈린 도메인을 함유하고, 이어서 녹색 형광 단백질(GFP)을 함유하고, N 말단 칼모듈린 결합 영역^35,36에 의해 캡핑된다. 칼슘-도메인이 칼모듈린 결합 영역과의 상호작용을 촉발시켜, 전체 단백질 구조의 형태적 변화 및 GFP 모이어티^35,36의 형광의 실질적인 증가를 초래한다. 수년에 걸쳐,이 기자 가족은 특정 동역학 (느리고, 중간, 빠름)을 가진 특정 칼슘 과도 상태에 대한 뚜렷한 판독을 가능하게하기 위해 몇 가지 진화를 거쳤으며, 각각은 약간 다른 특성을 가지고 있습니다^37,38. 여기서, GcaMP6 리포터의 용도가 강조되었으며, 이는 생체내 및 시험관내 둘 다에서 뉴런에서 단일 작용 전위 및 수지상 칼슘 과도기를 검출하는 것으로 이전에 보여졌다³⁷.

시냅스 전 영역의 칼슘 과도 상태는 시냅스 소포 융합 이벤트를 유발하여 시냅스 내로 신경 전달 물질 방출을 유발하고 시냅스 후 세포에서 신호 전달 이벤트를 시작합니다^28,39. 시냅스 소포는 세포가 동종 정적으로 안정적인 세포막 표면적을 유지하고 융합 가능한 막 결합 소포의 쉽게 분리 가능한 풀을 유지하기 때문에 빠르게 방출되고 재활용됩니다⁴⁰. 여기서 사용되는 스티릴 염료는 지질막에 대한 친화력을 가지며, 특히 주변 지질 환경의 순서에 따라 방출 특성을 변화시킨다^41,42. 따라서, 그것은 시냅스 소포를 재활용하고 신경 자극 후 나중에 방출되는 이러한 소포의 후속 추적에 이상적인 도구입니다^41,42. 생성되고 최적화 된 프로토콜은 Gaffield와 동료들에 의해 초기에 설명 된 개념의 적응이며, 이는 시간이 지남에 따라 스티릴 염료 표지 시냅스 베시클 누자를 지속적으로 시각화 할 수있게 해줍니다⁴¹.

여기에서, 두 개의 관련 형광-기반 방법론이 설명되고, 시냅스 전달에 관여하는 특정 세포 사건을 확실하게 보고한다. 프로토콜은 배양된 뉴런에서 탈분극 매개 시냅스 전 말단 칼슘 유입 및 시냅스 소포 외세포증의 역학을 조사하기 위해 정의되었다. 여기서, 방법 및 대표적인 결과는 일차 설치류 피질 또는 운동 뉴런을 시험관내 모델 시스템으로서 사용하는 것에 초점을 맞추고 있으며, 이들 세포 유형^43,44을 이용한 발표된 연구가 있다. 그러나 이러한 방법은 분화 된 인간 ⁱ³ 피질 유사 뉴런에도 적용 할 수 있습니다.⁴⁵ 우리 실험실에서 현재 진행중인 실험에서 두 프로토콜 모두에서 성공을 거두었습니다. 일반 프로토콜은 그림 1에 표시된 단계적 선형 형식으로 요약되어 있습니다. 간단히 말해서, 뉴라이트에서 칼슘 역학을 연구하기 위해, 성숙한 뉴런은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 ^37,46 하에 형광 리포터 GCaMP6m을 발현하기 위해 플라스미드 DNA로 형질감염된다. 형질감염된 세포는 낮은 수준의 기저 녹색 형광을 가지며, 이는 칼슘의 존재 하에서 증가한다. 관심 영역은 우리의 조작 전반에 걸쳐 형광 변화를 모니터링하기 위해 지정됩니다. 이를 통해 칼슘의 고도로 공간적, 시간적으로 국소화된 변동을 측정할 수 있습니다^37,46. 시냅스 소포 융합 및 방출을 평가하기 위해, 성숙한 뉴런은 시냅스 전 세포에서 신경 전달 물질로 재활용, 변형 및 재장전됨에 따라 시냅스 소포막에 통합 된 스티릴 염료가 로딩됩니다41,42,43,47,48. 이 목적을 위해 사용되는 현재 염료는 신경돌기를 따라 시냅스 소포를 라벨링하고 Kraszewski와 동료⁴⁹에 의해 스티릴 염료와 시냅토타민의 공동 염색에 의해 나타난 바와 같이 라이브 이미징 실험에서 이들 영역에 대한 프록시로 사용된다. 여기에는 유사한 염색이 또한 수행되었던 대표적인 이미지들이 포함된다(도 2A). 이전의 연구자들은 신경근 접합부와 해마 뉴런에서 시냅스 소포 역학을보고하기 위해 이러한 염료를 광범위하게 사용했습니다.48,49,50,51,52,53,54,55,56 . 염료가 로딩된 소포의 펑크 영역을 선택하고 소포 방출 후 형광 강도의 감소를 모니터링함으로써, 자극 후 기능적 시냅스 전달 능력 및 방출의 시간적 역학을 연구할 수 있다⁴³. 두 방법 모두에 대해, 고농도의 염화칼륨을 함유하는 배지가 뉴런 활성을 모방하기 위해 세포를 탈분극시키기 위해 사용된다. 이미징 파라미터는 기준선 정규화에 걸친 서브초 간격을 캡처하고 자극 캡처 기간을 따르도록 지정됩니다. 각 시점에서의 형광 측정은 결정되고, 배경으로 정규화되고, 실험 기간에 걸쳐 정량화된다. 칼슘-매개 GCaMP6m 형광 증가 또는 효과적인 시냅스 베시클 엑소사이토시스 스티릴 염료 방출 형광 감소는 이러한 전략을 통해 검출될 수 있다. 이 두 프로토콜에 대한 자세한 방법론적 설정 및 매개 변수와 그 장점과 한계에 대한 논의는 아래에 설명되어 있습니다.

그림 1: 전체 일반 프로토콜 프로세스의 시각적 렌더링. (1) 1차 설치류 뉴런을 시험관 내에서 분리하고 배양하여 선택된 성숙 시점으로 한다. (2) GCaMP DNA 또는 스티릴 염료를 시냅스 활성의 리포터로 도입한다. (3) 라이브 이미징이 장착 된 공초점 현미경 및 관련 소프트웨어를 사용하여 이미징 패러다임을 설정합니다. 초기 계획 기록 기간을 시작합니다. (4) 세포가 여전히 라이브 이미지 캡처를 겪고있는 동안, 높은 KCl 목욕 관류를 통해 뉴런을 자극하십시오. (5) 칼슘 과도 상태 또는 시냅스 소포 융합을 측정하기 위해 시간에 따른 형광 강도 측정을 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.