Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

El modelado de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el laboratorio se hace excepcionalmente desafiante debido a la naturaleza abrumadoramente esporádica de más del 80% de los ^casos1, junto con la gran cantidad de mutaciones genéticas que se sabe que son causantes de la ^enfermedad2. A pesar de esto, todos los casos de ELA comparten la característica unificadora de que antes de la degeneración neuronal absoluta, existe una comunicación disfuncional entre las neuronas motoras presinápticas y las células musculares postsinápticas3,4. Clínicamente, a medida que los pacientes pierden la conectividad de las neuronas motoras superiores e inferiores restantes, se presentan con características de hiper e hipoexcitabilidad neuronal a lo largo de la ^{enfermedad5,6,7,8,9}, lo que refleja complejos cambios moleculares subyacentes a estas sinapsis, que nosotros, como investigadores de ELA, buscamos comprender.

Múltiples modelos transgénicos han ilustrado que el deterioro y la desorganización de la unión neuromuscular ocurren con la expresión de mutaciones genéticas causantes de ELA, incluyendo ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 y TDP4317,18,19 a través de evaluaciones morfológicas, incluida la evaluación de boutones sinápticos, densidades de la columna vertebral y organización pre / postsináptica. Mecánicamente, desde los documentos históricos de Cole, Hodgkin y Huxley en la década de 1930, también ha sido posible evaluar las respuestas sinápticas a través de técnicas electrofisiológicas en cultivo celular in vitro o preparaciones de rebanadas de ^tejidos20. A través de estas estrategias, muchos modelos de ELA han demostrado déficits de transmisión sináptica. Por ejemplo, una variante mutante de TDP43 provoca una mayor frecuencia de disparo y disminuye el umbral de potencial de acción en células motoras-neuronales similares a las neuronas NSC-34 (línea celular híbrida de médula espinal x neuroblastoma 34⁾²¹. Esta misma variante también causa transmisión sináptica disfuncional en la unión neuromuscular (NMJ) antes de la aparición de déficits motores conductuales en un modelo de ^ratón22. Anteriormente se demostró que la expresión mutante de FUS resulta en una reducción de la transmisión sináptica en el NMJ en un modelo de drosophila de FUS-ALS antes de defectos ^{locomotores11}. Un informe reciente utilizando células madre pluripotentes inducidas derivadas de portadores de expansión C9orf72 reveló una reducción en el grupo fácilmente liberable de vesículas ^{sinápticas23}. En conjunto, estos estudios y otros destacan la importancia de construir una comprensión más completa de los mecanismos subyacentes a la señalización sináptica en modelos de ELA relevantes para la enfermedad. Esto será fundamental para comprender la patobiología de la ELA y desarrollar posibles objetivos terapéuticos para los pacientes.

Los métodos de sujeción de corriente y voltaje de las células han sido invaluables para determinar las propiedades de la membrana, como la conductancia, el potencial de membrana en reposo y el contenido cuantal de las sinapsis ^{individuales20,24}. Sin embargo, una de las limitaciones significativas de la electrofisiología es que es técnicamente desafiante y solo proporciona información de una sola neurona a la vez. La microscopía confocal de células vivas, junto con sondas fluorescentes específicas, ofrece la oportunidad de investigar la transmisión sináptica de neuronas de manera espaciotemporal25,26,27. Aunque no es una medida directa de la excitabilidad neuronal, este enfoque de fluorescencia puede proporcionar una medición relativa de dos correlaciones moleculares de la función sináptica: la liberación de vesículas sinápticas y los transitorios de calcio en los terminales sinápticos.

Cuando un potencial de acción alcanza la región terminal presináptica de las neuronas, se desencadenan transitorios de calcio, facilitando la transición de una señal eléctrica al proceso de liberación de ^{neurotransmisores28}. Los canales de calcio dependientes de voltaje localizados en estas áreas regulan estrechamente la señalización de calcio para modular la cinética de la liberación de ^{neurotransmisores29}. Los primeros registros basados en fluorescencia reportados de transitorios de calcio se realizaron utilizando el indicador de longitud de onda dual Fura-2 AM o el tinte de longitud de onda única Fluo-3 AM30,31,32. Si bien estos colorantes ofrecieron una gran visión nueva en ese momento, sufren de varias limitaciones, como la compartimentación inespecífica dentro de las células, la pérdida activa o pasiva de colorantes de las células marcadas, el fotoblanqueo y la toxicidad si se toman imágenes durante largos períodos de ^tiempo33. En la última década, los indicadores de calcio codificados genéticamente se han convertido en los caballos de batalla para obtener imágenes de diversas formas de actividad neuronal. Estos indicadores combinan una proteína fluorescente modificada con una proteína quelante de calcio que cambia rápidamente la intensidad de la fluorescencia después de la unión de iones ^Ca2+34. La aplicación de estos nuevos indicadores es amplia, lo que permite una visualización mucho más fácil de los transitorios de calcio intracelulares tanto en entornos in vitro como in vivo. Una familia de estos reporteros codificados genéticamente, conocida como GCaMP, ahora se utiliza ampliamente. Estos indicadores contienen un dominio de calmodulina C-terminal, seguido de proteína fluorescente verde (GFP), y están limitados por una región de unión a calmodulina ^{N-terminal35,36}. La unión del calcio al dominio de la calmodulina desencadena una interacción con la región de unión a la calmodulina, lo que resulta en un cambio conformacional en la estructura general de la proteína y un aumento sustancial en la fluorescencia de la fracción ^GFP35,36. A lo largo de los años, esta familia de reporteros ha experimentado varias evoluciones para permitir lecturas distintas para transitorios de calcio particulares con cinética específica (lenta, media y rápida), cada uno con propiedades ligeramente ^{diferentes37,38}. Aquí, se ha destacado el uso del reportero GcaMP6, que previamente se ha demostrado que detecta potenciales de acción única y transitorios de calcio dendríticos en neuronas tanto in vivo como de ^vitro37.

Los transitorios de calcio en la región presináptica desencadenan eventos de fusión de vesículas sinápticas, causando la liberación de neurotransmisores en la sinapsis y el inicio de eventos de señalización en la célula postsináptica28,39. Las vesículas sinápticas se liberan y reciclan rápidamente, ya que la célula mantiene homeostáticamente un área de superficie de membrana celular estable y un grupo fácilmente liberable de vesículas unidas a la membrana con capacidad de ^fusión40. El colorante de estirilo utilizado aquí tiene una afinidad hacia las membranas lipídicas y cambia específicamente sus propiedades de emisión en función del orden del entorno lipídico ^{circundante41,42}. Por lo tanto, es una herramienta ideal para el etiquetado de vesículas sinápticas de reciclaje y el posterior seguimiento de estas vesículas a medida que se liberan posteriormente tras la estimulación ^{neuronal41,42}. El protocolo que se ha generado y optimizado es una adaptación de los conceptos descritos inicialmente por Gaffield y sus colegas, lo que nos permite visualizar la punción de vesícula sináptica marcada con colorante de estirilo a lo largo del tiempo ^{de forma continua41}.

Aquí, se describen dos metodologías relacionadas basadas en la fluorescencia, que informan de manera confiable eventos celulares específicos involucrados en la transmisión sináptica. Se han definido protocolos para sondear la dinámica de la afluencia de calcio terminal presináptico mediada por despolarización y la exocitosis de vesículas sinápticas en neuronas cultivadas. Aquí, los métodos y resultados representativos se centran en el uso de neuronas corticales o motoras primarias de roedores como sistema modelo in vitro, ya que existen estudios publicados que utilizan estos tipos de células43,44. Sin embargo, estos métodos también son aplicables a neuronas humanas ⁱ³ de tipo cortical ^{diferenciadas45}, ya que también hemos tenido éxito con ambos protocolos en la experimentación actualmente en curso en nuestro laboratorio. El protocolo general se describe en un formato lineal paso a paso, que se muestra en la Figura 1. En resumen, para estudiar la dinámica del calcio en neuritas, las neuronas maduras se transfectan con ADN plásmido para expresar el reportero fluorescente GCaMP6m bajo un promotor de citomegalovirus (CMV)^37,46. Las células transfectadas tienen un bajo nivel de fluorescencia verde basal, que aumenta en presencia de calcio. Las regiones de interés se especifican para monitorear los cambios de fluorescencia a lo largo de nuestra manipulación. Esto permite medir fluctuaciones altamente localizadas espacial y temporalmente en el ^calcio37,46. Para evaluar la fusión y liberación de vesículas sinápticas, las neuronas maduras se cargan con colorante de estirilo incorporado en las membranas de vesículas sinápticas a medida que se reciclan, reforman y recargan con neurotransmisores en células presinápticas41,42,43,47,48. Los colorantes actuales utilizados para este propósito etiquetan vesículas sinápticas a lo largo de las neuritas y se utilizan como un proxy para estas regiones en experimentos de imágenes en vivo, como lo demostró la tinción conjunta de tinte de estirilo y sinaptotagmina por Kraszewski y sus ^colegas49. Aquí se incluyen imágenes representativas de tinción similar que también se han realizado (Figura 2A). Investigadores anteriores han utilizado ampliamente tales colorantes para informar la dinámica de las vesículas sinápticas en la unión neuromuscular y las neuronas del hipocampo48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Mediante la selección de regiones punteadas de vesículas cargadas con colorante y mediante el seguimiento de las disminuciones en la intensidad de fluorescencia después de la liberación de vesículas, se puede estudiar la capacidad de transmisión sináptica funcional y la dinámica temporal de liberación después de la ^{estimulación43}. Para ambos métodos, se emplea un medio que contiene una alta concentración de cloruro de potasio para despolarizar las células para imitar la actividad neuronal. Los parámetros de imagen se especifican para capturar intervalos de menos de un segundo que abarcan una normalización basal seguida de nuestro período de captura de estimulación. Las mediciones de fluorescencia en cada punto de tiempo se determinan, normalizan en segundo plano y cuantifican durante el período de tiempo experimental. El aumento de la fluorescencia GCaMP6m mediado por la afluencia de calcio o la disminución efectiva de la exocitosis de la exocitosis de la exocitosis del colorante estirílico se pueden detectar a través de esta estrategia. A continuación se describen la configuración metodológica detallada y los parámetros para estos dos protocolos y una discusión sobre sus ventajas y limitaciones.

Figura 1: Representación visual del proceso general del protocolo general. (1) Aislar y cultivar neuronas primarias de roedores in vitro hasta el punto de tiempo de maduración elegido. (2) Introducir ADN GCaMP o colorante de estirilo como reporteros de la actividad sináptica. (3) Configurar el paradigma de imágenes utilizando un microscopio confocal equipado con imágenes en vivo y el software asociado. Comience el período de registro de línea de base. (4) Mientras las células todavía están experimentando la captura de imágenes en vivo, estimule las neuronas a través de una perfusión de baño de KCl alto. (5) Evaluar las mediciones de la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo para medir los transitorios de calcio o la fusión de vesículas sinápticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.