Summary

Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína

Published: May 18, 2021
doi:

Summary

A proteína de anticorpos recombinantes expressa em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e anticorpos monoclonais produzidos usando a tecnologia tradicional de hibridoma pode reconhecer e ligar-se à proteína N aminopeptidase suína (APN).

Abstract

A aminopeptidase N suína (PNA), uma metalopeptidase ligada à membrana abundantemente presente na mucosa do intestino delgado, pode iniciar uma resposta imune mucosa sem qualquer interferência, como baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais. Isso torna a APN uma candidata atraente no desenvolvimento de vacinas que visam seletivamente o epitélio da mucosa. Estudos anteriores mostraram que a PNA é uma proteína receptora tanto para Escherichia coli (E. coli) F4 enterotoxigênica quanto para o vírus da gastroenterite transmissível. Assim, a APN mostra-se promissora no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga ou novas vacinas baseadas em anticorpos específicos da APN. Neste estudo, comparamos a produção de anticorpos monoclonais específicos para APN (mAbs) usando a tecnologia tradicional de hibridoma e o método de expressão de anticorpos recombinantes. Nós também estabelecemos uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) transfectada de forma estável usando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e uma cepa BL21(DE3) de expressão de E. coli abrigando o vetor pET28a (+)-rAbs-APN. Os resultados mostram que anticorpos expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs produzidos usando hibridomas podem reconhecer e se ligar à proteína APN. Isso fornece a base para uma maior elucidação da função do receptor de APN para o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas a diferentes epítopos específicos de APN.

Introduction

A aminopeptidase N (APN), enzima pertencente à família das metaloproteinases M1, atua como marcador, receptor e molécula sinalizadora tumoral por vias dependentes e independentes de enzimas 1,2. Além de clivar os resíduos de aminoácidos N-terminais de vários peptídeos bioativos para a regulação de sua atividade biológica, a PNA desempenha um papel importante na patogênese de várias doenças inflamatórias. A PNA participa do processamento e apresentação de antígenos por peptídeos aparados que se ligam firmemente a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade 2,3. A PNA também exerce efeitos anti-inflamatórios ao se ligar a receptores acoplados à proteína G, participando de transdução de múltiplos sinais, modulando a secreção de citocinas e contribuindo para a fagocitose mediada pelo receptor gama Fc na resposta imune 4,5,6,7.

Como uma exopeptidase ligada à membrana amplamente distribuída, a PNA é abundante na mucosa do intestino delgado suíno e está intimamente associada à endocitose mediada por receptores 1,5,8. A PNA reconhece e liga a proteína spike do vírus da gastroenterite transmissível para entrada celular e interage diretamente com a subunidade FaeG das fímbrias F4 de Escherichia coli enterotoxigênicas para afetar a aderência bacteriana com as células hospedeiras 9,10,11. Assim, a PNA é um potencial alvo terapêutico no tratamento de doenças infecciosas virais e bacterianas.

Desde o desenvolvimento da tecnologia de hibridoma e outras estratégias para a produção de anticorpos monoclonais (mAbs) em 1975, os mAbs têm sido amplamente utilizados em imunoterapia, liberação de fármacos e diagnóstico12,13,14. Atualmente, os mAbs são utilizados com sucesso no tratamento de doenças, como câncer, doença inflamatória intestinal e esclerosemúltipla12,15. Devido à sua forte afinidade e especificidade, os mAbs podem ser alvos ideais no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga (ADC) ou novas vacinas16,17. A proteína APN é crítica para a entrega seletiva de antígenos a células específicas, podendo provocar uma resposta imune específica e forte da mucosa contra patógenos sem qualquer interferência, incluindo baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais 5,8,18. Portanto, produtos terapêuticos à base de mAbs específicos para APN mostram-se promissores contra infecções bacterianas e virais. Neste estudo, descrevemos a produção de mAbs específicos para APN usando tecnologia de hibridoma e a expressão de anticorpos recombinantes anti-APN (rAbs) usando vetores procarióticos e eucarióticos. O resultado indica que a proteína APN foi reconhecida tanto por rAbs expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO quanto por mAbs derivados de hibridomas.

Protocol

Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yangzhou (SYXK20200041). 1. Preparação do antígeno da proteína APN suína NOTA: A cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e as células pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 expressas de APN foram construídas em um estudo anterior11. Recuperar bactérias de um estoque congelado de glicerol e estriar em placas de Luria…

Representative Results

Neste estudo, a proteína solúvel purificada de APN (2,12 mg/mL) foi usada para imunização em camundongos. Camundongos imunizados com a proteína APN quatro vezes em intervalos de 14 dias exibiram um título mais alto de anticorpos contra APN em seus soros. Embora 14 hibridomas tenham sido obtidos usando os experimentos de fusão, apenas 9 hibridomas sobreviveram aos três ciclos contínuos de congelamento-descongelamento, resultando em 9 clones estáveis que secretaram anticorpos contra a PNA. Todas essas células s?…

Discussion

A indução da imunidade da mucosa é uma das abordagens mais eficazes no combate a patógenos e na prevenção e tratamento de várias doenças. A PNA, uma proteína ligada à membrana altamente expressa na mucosa intestinal, está envolvida na indução da resposta imune adaptativa e na endocitose viral e bacteriana mediada por receptores 1,5,8. A PNA é usada como particulada antigênica em muitos formatos de carregamento de …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pela Bolsa da Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072820, 31702242), subsídios da Bolsa do Governo de Jiangsu para Estudos no Exterior (JS20190246) e Talentos de Alto Nível da Fundação de Pesquisa Científica da Universidade de Yangzhou, um projeto fundado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu.

Materials

Complete Freund’s adjuvant Sigma-Aldrich F5881 Animal immunization
DAPI Beyotime  Biotechnology C1002 Nuclear counterstain
DMEM Gibco 11965092 Cell culture
DMEM-F12 Gibco 12634010 Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody Abbkine A23310 Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8 Beyotime  Biotechnology C0042 Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum Gibco 10091 Cell culture
Geneticin™ Selective Antibiotic Gibco 11811098 Selective antibiotic
HAT Supplement (50X) Gibco 21060017 Cell selection
HT Supplement (100X) Gibco 11067030 Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant Sigma-Aldrich F5506 Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside Sigma-Aldrich I5502 Protein expression
kanamycin Beyotime  Biotechnology ST102 Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems  SP8 STED Fluorescence imaging
Lipofectamine® 2000 Reagent Thermofisher 11668019 Transfection
LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting BD FACS LSRFortessa Flow cytometry
Microplate reader BioTek BOX 998 ELISA analysis
Micro spectrophotometer Thermo Fisher Nano Drop one Nucleic acid concentration detection
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 Culture broth
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 Culture broth
Opti-MEM Gibco 31985088 Cell culture
Polyethylene glycol 1500 Roche Diagnostics 10783641001 Cell fusion
PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit Takara Bio RR047 qPCR
protein A agarose Beyotime  Biotechnology P2006 Antibody protein purification
Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns MACHEREY-NAGEL 745120.5 Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP Southern Biotech May-00 Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit Beyotime  Biotechnology D7010S Construction of plasmids
Shake flasks Beyotime  Biotechnology E3285 Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer Beyotime  Biotechnology C0221A Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad  170-3940 Western blot
Tryptone Oxoid LP0042 Culture broth
Ultrasonic Homogenizer Ningbo Xinzhi Biotechnology JY92-IIN Sample homogenization
Yeast extract Oxoid LP0021 Culture broth
96-well microplate Corning 3599 Cell culture

Referências

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Citar este artigo
Xia, P., Lian, S., Wu, Y., Yan, L. Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium. J. Vis. Exp. (171), e62437, doi:10.3791/62437 (2021).

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