Production d’anticorps monoclonaux ciblant l’aminopeptidase N dans l’épithélium de la muqueuse intestinale porcine
Summary
La protéine d’anticorps recombinante exprimée dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les anticorps monoclonaux produits à l’aide de la technologie traditionnelle de l’hybridome peut reconnaître et se lier à la protéine porcine aminopeptidase N (APN).
Abstract
L’aminopeptidase porcine N (APN), une métallopeptidase membranaire abondamment présente dans la muqueuse intestinale grêle, peut déclencher une réponse immunitaire muqueuse sans aucune interférence telle qu’une faible expression protéique, une inactivité enzymatique ou des changements structurels. Cela fait de l’APN un candidat attrayant dans le développement de vaccins qui ciblent sélectivement l’épithélium muqueux. Des études antérieures ont montré que l’APN est une protéine réceptrice à la fois pour Escherichia coli entérotoxinogène (E. coli) F4 et pour le virus de la gastro-entérite transmissible. Ainsi, l’APN est prometteur dans le développement de conjugués anticorps-médicament ou de nouveaux vaccins basés sur des anticorps spécifiques de l’APN. Dans cette étude, nous avons comparé la production d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN (mAbs) en utilisant la technologie traditionnelle de l’hybridome et la méthode d’expression des anticorps recombinants. Nous avons également établi une lignée cellulaire d’ovaire de hamster chinois (CHO) à transfectation stable en utilisant pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN et une souche d’expression d’E. coli BL21(DE3) hébergeant le vecteur pET28a (+)-rAbs-APN. Les résultats montrent que les anticorps exprimés dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les AcM produits à l’aide d’hybridomes pourraient reconnaître et se lier à la protéine APN. Cela fournit la base pour une élucidation plus poussée de la fonction du récepteur APN pour le développement de thérapies ciblant différents épitopes spécifiques de l’APN.
Introduction
L’aminopeptidase N (APN), une enzyme de travail au noir appartenant à la famille des métalloprotéinases M1, agit comme marqueur tumoral, récepteur et molécule de signalisation via des voies dépendant des enzymes et indépendantes des enzymes 1,2. En plus de cliver les résidus d’acides aminés N-terminaux de divers peptides bioactifs pour la régulation de leur activité biologique, l’APN joue un rôle important dans la pathogenèse de diverses maladies inflammatoires. L’APN participe au traitement et à la présentation des antigènes par des peptides parés qui se lient étroitement aux molécules majeures du complexe d’histocompatibilité de classe II 2,3. L’APN exerce également des effets anti-inflammatoires en se liant aux récepteurs couplés aux protéines G participant à la transduction de signaux multiples, modulant la sécrétion de cytokines et contribuant à la phagocytose médiée par le récepteur gamma Fc dans la réponse immunitaire 4,5,6,7.
En tant qu’exopeptidase membranaire largement distribuée, l’APN est abondante dans la muqueuse intestinale grêle porcine et est étroitement associée à l’endocytose médiée par les récepteurs 1,5,8. L’APN reconnaît et lie la protéine de pointe du virus de la gastro-entérite transmissible pour l’entrée cellulaire, et interagit directement avec la sous-unité FaeG des fimbriae entérotoxinogènes Escherichia coli F4 pour affecter l’adhérence bactérienne avec les cellules hôtes 9,10,11. Ainsi, l’APN est une cible thérapeutique potentielle dans le traitement des maladies infectieuses virales et bactériennes.
Depuis le développement de la technologie des hybridomes et d’autres stratégies pour la production d’anticorps monoclonaux (mAbs) en 1975, les AcM ont été largement utilisés en immunothérapie, en administration de médicaments et en diagnostic12,13,14. Actuellement, les AcM sont utilisés avec succès pour traiter des maladies telles que le cancer, les maladies inflammatoires de l’intestin et la sclérose en plaques12,15. En raison de leur forte affinité et spécificité, les AcM peuvent être des cibles idéales dans le développement de conjugués anticorps-médicament (ADC) ou de nouveaux vaccins16,17. La protéine APN est essentielle pour délivrer sélectivement des antigènes à des cellules spécifiques et peut provoquer une réponse immunitaire muqueuse spécifique et forte contre les agents pathogènes sans aucune interférence, y compris une faible expression protéique, une inactivité enzymatique ou des changements structurels 5,8,18. Par conséquent, les produits thérapeutiques à base d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN sont prometteurs contre les infections bactériennes et virales. Dans cette étude, nous décrivons la production d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN à l’aide de la technologie de l’hybridome et l’expression d’anticorps recombinants anti-APN (rAbs) à l’aide de vecteurs procaryotes et eucaryotes. Le résultat indique que la protéine APN a été reconnue à la fois par les AcR exprimés dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les mAbs dérivés d’hybridomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’induction de l’immunité muqueuse est l’une des approches les plus efficaces pour contrer les agents pathogènes et pour prévenir et traiter diverses maladies. L’APN, une protéine membranaire fortement exprimée dans la muqueuse intestinale, est impliquée dans l’induction de la réponse immunitaire adaptative et dans l’endocytose virale et bactérienne médiée par les récepteurs 1,5,8. L’APN est utilisé com…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la subvention de la Fondation nationale chinoise des sciences (n ° 32072820, 31702242), des subventions de la bourse du gouvernement du Jiangsu pour les études à l’étranger (JS20190246) et des talents de haut niveau de la Fondation de recherche scientifique de l’Université de Yangzhou, un projet fondé par le programme académique prioritaire du développement de l’établissement d’enseignement supérieur du Jiangsu.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
Referências
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