Produzione di anticorpi monoclonali contro l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina
Summary
La proteina anticorpale ricombinante espressa nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e negli anticorpi monoclonali prodotti utilizzando la tecnologia tradizionale dell’ibridoma possono riconoscere e legarsi alla proteina N dell’aminopeptidasi suina (APN).
Abstract
L’aminopeptidasi suina N (APN), una metallopeptidasi legata alla membrana abbondantemente presente nella mucosa dell’intestino tenue, può avviare una risposta immunitaria della mucosa senza alcuna interferenza come bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali. Ciò rende APN un candidato interessante nello sviluppo di vaccini che colpiscono selettivamente l’epitelio della mucosa. Studi precedenti hanno dimostrato che l’APN è una proteina recettore sia per l’Escherichia coli enterotossigenico (E. coli) F4 che per il virus della gastroenterite trasmissibile. Pertanto, APN mostra risultati promettenti nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco o nuovi vaccini basati su anticorpi APN-specifici. In questo studio, abbiamo confrontato la produzione di anticorpi monoclonali APN-specifici (mAbs) utilizzando la tecnologia tradizionale dell’ibridoma e il metodo di espressione degli anticorpi ricombinanti. Abbiamo anche stabilito una linea cellulare di ovaio di criceto cinese (CHO) stabilmente trasfettata utilizzando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e un ceppo di espressione BL21 (DE3) di E. coli che ospita il vettore pET28a (+)-rAbs-APN. I risultati mostrano che gli anticorpi espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs prodotti utilizzando ibridomi potrebbero riconoscere e legarsi alla proteina APN. Ciò fornisce la base per ulteriori chiarimenti sulla funzione del recettore APN per lo sviluppo di terapie mirate a diversi epitopi specifici dell’APN.
Introduction
L’aminopeptidasi N (APN), un enzima che appartiene alla famiglia delle metalloproteinasi M1, agisce come marcatore tumorale, recettore e molecola di segnalazione attraverso vie enzima-dipendenti ed enzima-indipendenti 1,2. Oltre a scindere i residui aminoacidici N-terminali di vari peptidi bioattivi per la regolazione della loro attività biologica, l’APN svolge un ruolo importante nella patogenesi di varie malattie infiammatorie. APN partecipa all’elaborazione e alla presentazione dell’antigene da parte di peptidi tagliati che si legano strettamente alle principali molecole di classe II del complesso di istocompatibilità 2,3. APN esercita anche effetti antinfiammatori legandosi con i recettori accoppiati a proteine G che partecipano alla trasduzione del segnale multiplo, modulando la secrezione di citochine e contribuendo alla fagocitosi mediata dal recettore Fc gamma nella risposta immunitaria 4,5,6,7.
Come esopeptidasi legata alla membrana ampiamente distribuita, l’APN è abbondante nella mucosa dell’intestino tenue suino ed è strettamente associata all’endocitosi mediata dal recettore 1,5,8. APN riconosce e lega la proteina spike del virus della gastroenterite trasmissibile per l’ingresso cellulare e interagisce direttamente con la subunità FaeG delle fimbrie enterotossigeniche di Escherichia coli F4 per influenzare l’aderenza batterica con le cellule ospiti 9,10,11. Pertanto, APN è un potenziale bersaglio terapeutico nel trattamento delle malattie infettive virali e batteriche.
Dopo lo sviluppo della tecnologia dell’ibridoma e di altre strategie per la produzione di anticorpi monoclonali (mAbs) nel 1975, i mAb sono stati ampiamente utilizzati nell’immunoterapia, nella somministrazione di farmaci e nella diagnosi12,13,14. Attualmente, i mAbs sono usati con successo per trattare malattie come il cancro, le malattie infiammatorie intestinali e la sclerosi multipla12,15. A causa della loro forte affinità e specificità, i mAb possono essere bersagli ideali nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco (ADC) o di nuovi vaccini16,17. La proteina APN è fondamentale per la somministrazione selettiva di antigeni a cellule specifiche e può suscitare una risposta immunitaria mucosa specifica e forte contro i patogeni senza alcuna interferenza, tra cui bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali 5,8,18. Pertanto, gli agenti terapeutici a base di mAbs specifici per APN mostrano risultati promettenti contro le infezioni batteriche e virali. In questo studio, descriviamo la produzione di mAbs APN-specifici utilizzando la tecnologia dell’ibridoma e l’espressione di anticorpi ricombinanti anti-APN (rAbs) utilizzando vettori procariotici ed eucariotici. Il risultato indica che la proteina APN è stata riconosciuta sia dagli rAbs espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO che dai mAb derivati dall’ibridoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’induzione dell’immunità mucosale è uno degli approcci più efficaci nel contrastare gli agenti patogeni e nella prevenzione e nel trattamento di varie malattie. L’APN, una proteina legata alla membrana altamente espressa nella mucosa intestinale, è coinvolta nell’induzione della risposta immunitaria adattativa e nell’endocitosi virale e batterica mediata dai recettori 1,5,8. APN è usato come antigene particolato in molti f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Chinese National Science Foundation Grant (n. 32072820, 31702242), dalle sovvenzioni della borsa di studio del governo di Jiangsu per gli studi all’estero (JS20190246) e High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, un progetto fondato dal Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
Referências
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