डेटा का सिग्नल-टू-शोर अनुपात माइक्रोक्रिस्टल से एक्स-रे विवर्तन माप करने में सबसे महत्वपूर्ण विचारों में से एक है। वीएमएक्सएम बीमलाइन ऐसे प्रयोगों के लिए कम शोर वाले वातावरण और माइक्रोबम प्रदान करता है। यहां, हम वीएमएक्सएम और अन्य माइक्रोफोकस मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइंस के लिए बढ़ते और कूलिंग माइक्रोक्रिस्टल के लिए नमूना तैयारी विधियों का वर्णन करते हैं।
एकल क्रिस्टल क्रायो-क्रिस्टलोग्राफी के लिए माइक्रोक्रिस्टल (<10 माइक्रोन) का बढ़ना एक गैर-तुच्छ चुनौती प्रस्तुत करता है। डेटा की गुणवत्ता में सुधार माइक्रोक्रिस्टल के लिए बीमलाइन ऑप्टिक्स, बीम स्थिरता और वेरिएबल बीम आकार के विकास के साथ देखा गया है, जो सबमिक्रॉन से माइक्रोन तक ध्यान केंद्रित कर रहा है, जैसे डायमंड लाइट सोर्स1पर वीएमएक्सएम बीमलाइन पर । नमूना पर्यावरण और नमूना तैयारी में सुधार के माध्यम से डेटा गुणवत्ता में और सुधार प्राप्त किया जाएगा। माइक्रोक्रिस्टल स्वाभाविक रूप से कमजोर विवर्तन उत्पन्न करते हैं, इसलिए सिग्नल-टू-शोर में सुधार गुणवत्ता एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए महत्वपूर्ण है और मुख्य रूप से पृष्ठभूमि शोर में कटौती से आएगा। एक विवर्तन प्रयोग में एक्स-रे पृष्ठभूमि शोर के प्रमुख स्रोत नमूने के आसपास के हवा पथ के साथ उनकी बातचीत से हैं, नमूना के आसपास अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण समाधान, क्रिस्टलीय बर्फ की उपस्थिति और किसी अन्य बीमलाइन इंस्ट्रूमेंटेशन या एक्स-रे खिड़कियों से बिखराव। वीएमएक्सएम बीमलाइन में शोर के इन सभी स्रोतों को कम करने के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन और एक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल शामिल है।
सबसे पहले, VMXm में एक इन-वैक्यूम नमूना वातावरण एक्स-रे स्रोत और नमूने के बीच हवा के रास्ते को हटा देता है। इसके बाद, वीएमएक्सएम में मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल क्रायोटेम से अनुकूलित कई प्रक्रियाओं और उपकरणों का उपयोग करते हैं। इनमें होले कार्बन सपोर्ट फिल्मों के साथ कॉपर ग्रिड, स्वचालित ब्लॉटिंग और डुबकी कूलिंग रोबोटिक्स तरल इथेन का उपयोग करना शामिल है। ये उपकरण कम शोर समर्थन पर न्यूनतम आसपास के तरल के साथ एक ही क्रायोटेम ग्रिड पर सैकड़ों माइक्रोक्रिस्टल की तैयारी को सक्षम करते हैं। वे क्रिस्टल के आसपास के किसी भी शेष तरल से क्रिस्टलीय बर्फ के गठन को भी कम करते हैं।
हम एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए वीएमएक्सएम बीमलाइन पर नमूनों को बढ़ते से पहले दृश्यमान प्रकाश और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके घुलनशील प्रोटीन माइक्रोक्रिस्टल की गुणवत्ता तैयार करने और उसका आकलन करने की प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। हम अच्छी गुणवत्ता वाले नमूनों के साथ-साथ उन लोगों के उदाहरण भी प्रदान करेंगे जिन्हें ऐसा करने के लिए आगे अनुकूलन और रणनीतियों की आवश्यकता होती है।
मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स) द्वारा जैविक अणुओं की उच्च-संकल्प संरचनाओं के निर्धारण के लिए एक प्रमुख बाधा एक उत्तरदायी आकार पर अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल का उत्पादन बनी हुई है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए कई रणनीतियां हैं , जो प्रोटीन जीन निर्माण डिजाइन से लेकर बड़े विरल मैट्रिक्स खोजों तक रासायनिक कॉकटेल के लिए हैं जो प्रारंभिक क्रिस्टल उत्पन्न कर सकते हैं2। उत्तरार्द्ध के लिए, अक्सर यह मामला होता है कि क्रिस्टलोग्राफर को संरचना निर्धारण अध्ययन के लिए पर्याप्त विवर्तन गुणवत्ता और आकार के साथ क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रारंभिक हिट को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी3। इन विकल्पों के बावजूद, कुछ लक्षित अणु कभी भी बड़े (>10 माइक्रोन) उत्पन्न नहीं कर सकते हैं, अच्छी तरह से डिफ्राडिंग क्रिस्टल और परिणामस्वरूप क्रिस्टलोग्राफर को अपने माइक्रोक्रिस्टल और ऐसे नमूनों के साथ चुनौतियों का सामना करना चाहिए। इनमें क्रिस्टल को उचित रूप से बढ़ते और क्रायो-प्रोटेक्ट करना, स्वाभाविक रूप से कमजोर विवर्तन का प्रबंधन करना और विकिरण संवेदनशीलता में वृद्धि करना शामिल है। माइक्रोक्रिस्टल बड़े क्रिस्टल की तुलना में कम इकाई कोशिकाओं और अणुओं से बनते हैं और इस तरह, विवर्तन बड़े क्रिस्टल की तुलना में उसी हद तक परिलक्षित नहीं होता है, जिसके परिणामस्वरूप स्वाभाविक रूप से कमजोर विवर्तन तीव्रता होती है। यह महत्वपूर्ण है कि पृष्ठभूमि संकेत इन प्रतिबिंबों को मुखौटा नहीं करता है, विशेष रूप से उच्च संकल्प पर जहां कमजोर प्रतिबिंब तीव्रता4खो सकती है। इसके अलावा, माइक्रोक्रिस्टल विकिरण क्षति के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और तरल नाइट्रोजन तापमान5पर विवर्तन रिकॉर्ड करने के बावजूद, एक क्रिस्टल से पूरा डेटा एकत्र करना संभव नहीं हो सकता है, जिससे एक पूर्ण डेटासेट 6 का उत्पादन करने के लिए बहुत बड़ी संख्या में क्रिस्टल से डेटा एकत्र करना आवश्यक होसकताहै।
एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (एक्सएफईएल) की बढ़ती उपलब्धता और धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी विधियों(एसएफएक्स) 7 के विकास ने छोटे माइक्रोक्रिस्टल से डेटा एकत्र करने के लिए मार्ग प्रदान किए हैं। हालांकि, ये बेस्पोक नमूना वितरण विधियां हैं, जिनके लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर विशेषज्ञता की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है, जहां प्रयोग कमरे के तापमान तक सीमित होते हैं और आमतौर पर नमूना खपत अधिक होती है (सैकड़ों माइक्रोलीटर) और अभी भी आगे अनुकूलन8की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, ऐसी परियोजनाएं जहां केवल सीमित मात्रा में माइक्रोक्रिस्टल बनाए जा सकते हैं, एसएफएक्स के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
इस बीच, हाल के दशकों में सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन प्रौद्योगिकी ने एक प्रतिभा के साथ छोटे, अधिक स्थिर बीम9 का उत्पादन करने के लिए प्रगति की है जिसने कभी छोटे क्रिस्टल10,11से डेटा संग्रह की अनुमति दी है। एनएसएलएस-II में एफएमएक्स और डायमंड लाइट सोर्स पर आई24 जैसे माइक्रोफोकस बीमलाइंस ~ 3 माइक्रोन12 के अधिकतम आयामों के साथ क्रिस्टल से उपन्यास संरचनाओं को निर्धारित करने में सक्षम रहे हैं और ~ 1 माइक्रोन13को मापने वाले छोटे क्रिस्टल से भी उपयोग करने योग्य डेटा एकत्र करने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। बीमलाइन को उत्कृष्ट, उच्च रिज़ॉल्यूशन ऑन-एक्सिस-व्यू ऑप्टिक्स, नमूना रोटेशन के लिए भ्रम का एक न्यूनतम क्षेत्र और एक्स-रे बीम के साथ संयोग है कि एक ठीक गठबंधन रोटेशन धुरी के साथ ठीक कॉन्फ़िगर किया जाना चाहिए। क्रिस्टल वॉल्यूम के लिए एक्स-रे बीम प्रोफाइल को बारीकी से मिलाना महत्वपूर्ण है और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि क्रिस्टल एक्स-रे बीम में ठीक से गठबंधन किया गया है – क्रिस्टल <5 माइक्रोन14के लिए एक चुनौती। माइक्रोक्रिस्टल से सर्वोत्तम गुणवत्ता वाले डेटा को रिकॉर्ड करने के लिए बीमलाइन पर इन प्रायोगिक स्थितियों को पूरा करना आवश्यक है।
माइक्रोक्रिस्टल से डेटा संग्रह का शेष और संभवतः सबसे महत्वपूर्ण पहलू एक्स-रे बीम के लिए क्रिस्टल की प्रस्तुति है। माइक्रोक्रिस्टल अक्सर माइक्रोमेश नमूना माउंट पर रखा गया है, जो पॉलीमाइड से निर्मित होता है, जो 10 माइक्रोन15, 16के रूप में छोटे एपर्चर के साथ कम एक्स-रे बिखरने वाली सामग्री है। पॉलीमाइड जाल को एक मानक पिन पर रखा जाता है जिसे चुंबकीय स्पाइन बेस में सेट किया जाता है, जिससे यह अधिकांश एमएक्स बीमलाइन17के साथ संगत होता है। जाल माउंट का उपयोग क्रिस्टलीकरण ड्रॉप से क्रिस्टल मछली के लिए किया जाता है, जो अक्सर एक मानक लूप शैली माउंट का उपयोग करके 100 माइक्रोन क्रिस्टल बढ़ते हुए एक ही प्रक्रिया का पालन करता है। जबकि क्रिस्टल जाल भर में वितरित किया जा सकता है, एक महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि तरल की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में जाल और पिन द्वारा किया जा सकता है, जबकि कटाई(चित्रा 1C,D)। तरल की यह मात्रा, जो क्रिस्टल से कई गुना बड़ी हो सकती है, एक्स-रे के साथ प्रकाशित होने पर पृष्ठभूमि शोर में योगदान देगी। यह पृष्ठभूमि बिखराव और भी मजबूत हो सकता है यदि तरल फ्लैश कूलिंग के दौरान क्रिस्टलीय बर्फ बनाता है, बर्फ विवर्तन के संकल्पों के भीतर पहले से ही कमजोर तीव्रता के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम करता है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि नमूना से अतिरिक्त तरल हटा दिया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी संभावित संकेतों को दर्ज किया जा सकता है। यह चुनौती लिपिड क्यूबिक चरण (एलसीपी) के भीतर बनने वाले झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल के मामले में और भी अधिक है, जहां एलसीपी मजबूत पृष्ठभूमि बिखराव उत्पन्न करता है और क्रिस्टल 18के आसपास से निकालना भी मुश्किल है।
डायमंड लाइट सोर्स पर नई बहुमुखी मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी माइक्रोफोकस (वीएमएक्सएम) बीमलाइन ऐसी स्थितियां प्रदान करती है जिनके साथ क्रिस्टल से डेटा एकत्र करना संभावित रूप से आकार में एक माइक्रोन से कम मापने के लिए है । बीमलाइन को 0.3 माइक्रोन एक्स 0.5 माइक्रोन (वीएक्सएच)1को मापने के लिए एक बीम प्रोफाइल वितरित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो भ्रम के क्षेत्र के साथ एक गोनियोमीटर है जो 60 एनएम से अधिक नहीं है और एक वैक्यू नमूना वातावरण में है। वीएमएक्सएम एंडस्टेशन की ये डिजाइन विशेषताएं नमूना14द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि के सबसे बड़े शेष स्रोत के साथ डेटा संग्रह के दौरान बीमलाइन उपकरण द्वारा पृष्ठभूमि एक्स-रे शोर की पीढ़ी को कम करते हैं।
वीएमएक्सएम बीमलाइन के लिए डिज़ाइन किए गए विशिष्ट नमूना तैयारी विधियां इस पृष्ठभूमि को कम करने और विवर्तन डेटा के सिग्नल-टू-शोर को और बेहतर बनाने का अवसर प्रदान करती हैं, जो डेटा की गुणवत्ता को अधिकतम करती है जिसे माइक्रोक्रेस्टल मापने से दर्ज किया जा सकता है <10 माइक्रोन। माइक्रोक्रिस्टल से कम पृष्ठभूमि विवर्तन के लिए यहां उल्लिखित कई आवश्यकताएं क्रायोजेनिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोटेम)19 और माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईड)20के लिए भी आम हैं। नतीजतन, क्रायोटेम नमूनों की तैयारी के लिए पहले से विकसित किए गए कई उपकरण माइक्रोक्रिस्टल की तैयारी के लिए कुछ अनुकूलन के साथ उपयुक्त हैं। एकल कण क्रायोटेम के लिए नमूनों की तैयारी में, जांच के तहत कणों को बहुत पतली परतों (आमतौर पर <100 एनएम) में एम्बेडेड किया जाता है, जैसे कि इलेक्ट्रॉन नमूने के माध्यम से संचारित करने में सक्षम होते हैं। पतली वर्दी परत को अतिरिक्त तरल को दूर करके प्राप्त किया जाता है और नमूने के विट्रीफिकेशन को नमूना (~ 104 K एस-1) 21को तेजी से ठंडा करके प्राप्त कियाजाता है, जो ~ 93 K22पर आयोजित तरल इथेन में जल्दी से आगे बढ़नेवाला है। इसके विपरीत, तरल नाइट्रोजन, जैसा कि एमएक्स नमूना तैयारी के लिए नियमित रूप से उपयोग किया जाता है, एथेन की तुलना में कम कुशल क्रायोजेन है और नमूना21के भीतर क्रिस्टलीय बर्फ गठन के लिए अधिक प्रवृत्ति है। क्रिस्टलीय बर्फ का गठन, जो विवर्तन को नीचा दिखा सकता है और पृष्ठभूमि शोर उत्पन्न कर सकता है, सामान्य रूप से क्रायो-प्रोटेक्टेंट यौगिकों23के उपयोग के माध्यम से कम किया जाता है। पॉली-एथिलीन ग्लाइकोल (खूंटी) 400 और मिथाइल-2, 4-पेंटानेडिओल (एमपीडी), शर्करा, तेल या संतृप्त लवण जैसे कम आणविक वजन वाले पॉलिमर को कम सांद्रता24में क्रिस्टलीकरण समाधान के एक एलिकोट में जोड़ा जा सकता है – सबसे उपयुक्त क्रायोप्रोटेक्टेंट का चयन करने के लिए एक ‘एक आकार फिट बैठता है सभी’ समाधान नहीं है और इसे अक्सर अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है . क्रिस्टल कटाई और क्रायो-सुरक्षा प्रक्रिया के दौरान कई जोड़तोड़ से भी गुजरता है जिसके परिणामस्वरूप क्रिस्टल को नुकसान हो सकता है, तरल इथेन का उपयोग करने का अवसर इस चरण की चूक की अनुमति देता है और क्रिस्टल की अखंडता की रक्षा करने में मदद करता है।
जबकि तरल इथेन नमूने की पतलीता के कारण माइक्रोक्रिस्टल (<10 माइक्रोन) के लिए एक प्रभावी क्रायोजन है, विशेष रूप से बड़े क्रिस्टल में क्रिस्टल के गठन को रोकने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं, जिसमें कसकर नियंत्रित आर्द्र वातावरण26के उपयोग से क्रिस्टल की पानी की सामग्री को कम करना, या क्रिस्टल27 के लूप और सतह दोनों से दूर तरल की बाती के माध्यम से , हालांकि, इन्हें फिर से नमूने में अधिक हेरफेर की आवश्यकता होती है। क्रायोटेम के रूप में तरल इथेन के साथ स्वचालित ब्लॉटिंग और डुबकी ठंड का उपयोग, अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण समाधान को एक साथ हटा दें और हेरफेर को कम करने का प्रयास करते हुए नियंत्रित तरीके से शांत माइक्रोक्रिस्टल को फ्लैश करने का साधन प्रदान करें।
यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जिसका उपयोग न केवल वीएमएक्सएम बीमलाइन के दोनों उपयोगकर्ताओं द्वारा और अन्य माइक्रोफोकस बीमलाइन पर उच्च सिग्नल-टू-शोर विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन सूक्ष्म प्रयोगों के लिए घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल और डिटर्जेंट आधारित झिल्ली क्रिस्टल नमूने तैयार करने वालों के लिए भी उपयोगी हो सकता है। जबकि नमूनों को तैयार करने और मूल्यांकन करने के लिए सभी सुविधाएं वीएमएक्सएम में उपलब्ध हैं, कई संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाएं क्रायोटेम नमूना तैयार करने के लिए तेजी से सुसज्जित हैं। नतीजतन, हम परिकल्पना करते हैं कि कुछ उपयोगकर्ता वीएमएक्सएम में बीमटाइम के लिए अपने नमूने तैयार करने के लिए अपनी सुविधाओं का उपयोग करना चाहते हैं।
यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि माइक्रोफोकस बीमलाइन पर एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए माइक्रोक्रिस्टल तैयार करने के लिए क्रायोटेम नमूना तैयारी से उपकरणों का उपयोग कैसे किया जा सकता है। मानक बीमलाइन इंस्ट्रूमेंटेशन पिन माउंटेड नमूने के चारों ओर केंद्रित है और जबकि माइक्रोक्रिस्टल के लिए इन माउंट पर नमूना समर्थन प्रदान करने के प्रयास किए गए हैं, वे अक्सर यह सुनिश्चित करते हुए नमूना के साथ लोड करना चुनौतीपूर्ण होते हैं कि उच्चतम सिग्नल-टू-शोर हासिल किया जाए(चित्रा 1सी, डी)। इनमें से कई नमूनों को यह सुनिश्चित करने के लिए क्रायो-सुरक्षा स्थितियों के अनुकूलन की भी आवश्यकता हो सकती है कि नमूना विट्रियस है। डुबकी ठंड विधि अतिरिक्त तरल को हटाने और एक कुशल क्रायोजेन(चित्रा 1ए, बी)में नमूना शांत करने के लिए एक दोहराने योग्य तरीका प्रदान करता है। जबकि ग्रिड को चिमटी-आधारित पिन माउंट के साथ एक मानक बीमलाइन पर रखा जा सकता है, वीएमएक्सएम नमूना धारकों को विशेष रूप से ग्रिड स्वीकार करने और उन्हें प्रवाहकीय शीतलन के माध्यम से वैक्यूम वातावरण में ग्लास संक्रमण तापमान से नीचे रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वीएमएक्सएम का नमूना वातावरण कम पृष्ठभूमि डेटा संग्रह को सक्षम बनाता है, जहां नमूना पृष्ठभूमि का शेष स्रोत है, और एक माइक्रोबम प्रदान करता है जिसका उपयोग क्रिस्टल को 10 माइक्रोन से कम आयामों के साथ मैच करने के लिए किया जा सकता है। इस नमूना तैयारी विधि का उपयोग इलेक्ट्रॉन विवर्तन के लिए नैनोक्रिस्टल तैयार करने के लिए भी किया जा सकता है जहां इलेक्ट्रॉनों के कमजोर प्रवेश के कारण बहुत कम अतिरिक्त तरल और एक विट्रियस नमूने की आवश्यकता भी होती है। जबकि क्रायोटेम ग्रिड नाजुक हैं, छोरों में क्रिस्टल की कटाई में अनुभवी लोग जल्दी से ग्रिड की हैंडलिंग के अनुकूल होंगे। अनुभव की एक छोटी राशि के साथ, कुछ ग्रिड ब्लॉटिंग, फ्रीजिंग और प्रोटोकॉल के लोडिंग चरणों के दौरान खो जाएंगे। हालांकि, अनुकूलन कदम इस सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं और सावधानीपूर्वक तैयारी क्रिस्टल खोने या क्रिस्टल अखंडता को कम करने की संभावना को कम करेगी।
क्रायोटेम ग्रिड एक अपेक्षाकृत बड़े एकल माउंट प्रदान करते हैं जिसमें कई सैकड़ों क्रिस्टल हो सकते हैं, इस प्रकार थ्रूपुट में सुधार हो सकता है जहां केवल विवर्तन डेटा की एक छोटी कील रिकॉर्ड करना संभव हो सकता है। एक एकल ग्रिड प्रोटीन संरचना को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त क्रिस्टल भी प्रदान कर सकता है, विशेष रूप से उच्च समरूपता के क्रिस्टल में। जहां केवल एक या दो एकल क्रिस्टलीकरण बूंदों ने माइक्रोक्रिस्टल उत्पन्न किए हैं, अकेले क्रिस्टलीकरण की स्थिति का परीक्षण ब्लॉटिंग यह सुनिश्चित करने में मदद कर सकता है कि जब माइक्रोक्रिस्टल ों को दाग दिया जाता है, तो उपयोग किए जाने वाले समय प्रारंभिक अच्छी गुणवत्ता वाले नमूनों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक लोगों के लिए जितना संभव हो उतना करीब होते हैं। कार्बन-फिल्म का समर्थन एक्स-रे के लिए अदृश्य हैं और अलग छेद रिक्ति के साथ उपलब्ध हैं, जिसका उपयोग एक विशेष आकृति विज्ञान के अनुरूप किया जा सकता है। हम सबसे अधिक एक 2 माइक्रोन रिक्ति पर 2 माइक्रोन छेद के साथ समर्थन फिल्मों का उपयोग करते हैं, लेकिन अधिक रिक्ति वाले छोटे छेद 2 माइक्रोन से छोटे क्रिस्टल के लिए अधिक उपयुक्त हो सकते हैं। अन्य समर्थन फिल्में जैसे कि 4 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ 1 माइक्रोन होल के साथ-साथ विभिन्न आकार के छेद के साथ समर्थन फिल्में उपलब्ध हैं, जो सभी ब्लॉटिंग समय को प्रभावित करेंगी। 200 (200 वर्ग प्रति इंच) का एक ग्रिड वर्ग जाल आकार भी कॉपर ग्रिड बार के बीच पर्याप्त स्थान (~ 100 माइक्रोन) प्रदान करता है ताकि एक्स-रे बीम क्रिस्टल से भरी कार्बन-फिल्म के लिए पर्याप्त संरचनात्मक समर्थन प्रदान करते हुए तांबे के साथ दृढ़ता से बातचीत न करे। तरल इथेन का उपयोग क्रायोप्रोटेक्टेंट की आवश्यकता को नकारता है, जो बदले में नमूना मात्रा पर आवश्यकता को कम करता है जिसका उपयोग क्रायोप्रोटेक्टेंट स्थितियों के अनुकूलन में किया जाता है।
प्रक्रिया के दौरान अनुकूलित किए जाने वाले मुख्य मापदंड ों में ब्लॉटिंग समय और नमूना कमजोर पड़ने हैं। ब्लॉटिंग समय ठंड में डुबकी लगाने से पहले ग्रिड की संपूर्णता में ‘पॉपिंग’ प्रभाव का पालन करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। अधिक दाग क्रिस्टल के निर्जलीकरण में परिणाम हो सकता है, हालांकि, नमूना कक्ष के भीतर आर्द्रता के नियंत्रण का उपयोग इस प्रभाव को कम करने के लिए किया जाता है। हालांकि यह सुझाव दिया जाता है कि 90% की सापेक्ष आर्द्रता का उपयोग किया जाता है, कुछ नमूनों को आर्द्रता के अनुकूलन में लाभ हो सकता है। आर्द्रता ब्लॉटिंग पेपर की ब्लॉटिंग दक्षता को प्रभावित कर सकती है जो धीरे-धीरे पानी से संतृप्त हो सकती है। इसके अतिरिक्त, नमूना कक्ष के भीतर आर्द्रता नियंत्रण क्रिस्टल30की विवर्तन गुणवत्ता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह सिफारिश की जाती है कि विवर्तन गुणवत्ता को अवक्रमित न करने के लिए विवर्तन अखंडता की जांच करने से पहले आर्द्रता में छोटे परिवर्तन (<5%) किए जाते हैं।
एसईएम के स्थान पर हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गैर-कीमती नमूनों का अनुकूलन किया जा सकता है। हालांकि विनाशकारी, यह ग्रिड भर में क्रिस्टल के घनत्व का आकलन करने और निर्णय लेने में सक्षम बनाने के लिए उपयोगी है कि क्या एक नमूना पतला किया जाना चाहिए या ग्रिड में क्रिस्टल को बेहतर ताने-फैलाने के लिए केंद्रित होना चाहिए। यह कदम सबसे उपयोगी है जब बड़ी संख्या में क्रिस्टल उपलब्ध हैं और विशेष रूप से अत्यधिक केंद्रित नमूने हैं। क्रिस्टल के साथ झुरमुट(चित्रा 3)से बचा जाना चाहिए, क्योंकि जबकि यह एक महत्वपूर्ण समस्या नहीं है यदि डेटा संग्रह 6 केदौरानएक ही समय में दो क्रिस्टल प्रकाशित किए जाते हैं, तो झुरमुट के आसपास तरल की एक बड़ी मात्रा होगी, इस प्रकार सिग्नल-टू-शोर(चित्रा 5)को कम किया जाएगा। हालांकि एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ग्रिड में तरल की बड़ी ज्यादतियों का पालन करना संभव है, माइक्रोक्रिस्टल के आसपास तरल की मात्रा का आकलन और क्रिस्टलीय बर्फ की उपस्थिति केवल एक क्रायोजेनिक वैक्यूम ट्रांसफर सिस्टम और चरण के साथ लगे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बनाई जा सकती है। कभी-कभी, ग्रिड में क्रिस्टल के आवेदन के बाद और ब्लॉटिंग होने से पहले, कम चिपचिपाहट समाधानों में क्रिस्टल ग्रिड के एक किनारे के साथ व्यवस्थित हो सकते हैं। हमने पाया है कि एथिलीन ग्लाइकोल की 50% अंतिम एकाग्रता को जोड़ने से बूंद के माध्यम से क्रिस्टल की आवाजाही धीमी हो सकती है, ग्रिड में माइक्रोक्रिस्टल का बेहतर वितरण सुनिश्चित करने के साथ-साथ ब्लॉटिंग समय(चित्रा 3डी)बढ़ाकर ब्लॉटिंग पर अधिक नियंत्रण प्रदान किया जा सकता है।
उच्च आणविक वजन पीईजी जैसे चिपचिपा उपजी एजेंटों वाले कुछ क्रिस्टलीकरण समाधान दाग के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो सकते हैं, जिसमें तेजी से लंबे समय तक ब्लॉटिंग समय (>10 एस) की आवश्यकता होती है। ऐसे मामलों में, ग्रिड के पीछे जमा तरल की मात्रा के साथ-साथ ग्रिड के समर्थन-फिल्म पक्ष के समाधान वाले क्रिस्टल की मात्रा को कम करने में सहायक हो सकता है। 31 इन कठिन मामलों में 2 परतों के ब्लॉटिंग पेपर या ग्लास फाइबर का उपयोग करने जैसी रणनीतियां भी31के कठिन मामलों में ब्लॉटिंग में सहायता कर सकती हैं ।
हालांकि यह पाइपलाइन घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल के लिए अनुकूल है, जो एलसीपी में झिल्ली प्रोटीन जैसे बहुत चिपचिपा माध्यमों में बनते हैं, एक अलग चुनौती पेश करते हैं जिसके लिए यह प्रोटोकॉल अनुकूल नहीं है। हालांकि, माइक्रोड के लिए क्रायोटेम ग्रिड पर एलसीपी क्रिस्टल तैयार करने के लिए रणनीतियां उभर रही हैं जिसमें एलसीपी में चरण परिवर्तन को प्रेरित करके नमूनों की चिपचिपाहट को कम करना शामिल है। यह नमूनों को इस लेख में वर्णित तरीके से ग्रिडों पर लागू करने की अनुमति देता है। अंत में, नमूना एक केंद्रित आयन बीम के साथ मिल सकता है अतिरिक्त गैर क्रिस्टल सामग्री32,33, 34को दूर करने के लिए।
कुल मिलाकर, इस पाइपलाइन में आम तौर पर नमूना उपलब्धता, क्रिस्टल की एकाग्रता और क्रिस्टलीकरण समाधान की चिपचिपाहट के आधार पर अच्छी तरह से फैलाया हुआ, विप्रीकृत नमूनों के साथ अनुकूलित ग्रिड प्रदान करने के लिए वीएमएक्सएम पर पहुंचने वाले नमूने से पालन करने के लिए 1-2 घंटे (उपकरण सेटअप समय सहित) लगेगा। माइक्रोक्रिस्टल पर विकिरण क्षति की खोज करने वाले एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए माइक्रोक्रिस्टल तैयार करने के लिए इन तरीकों को पहले ही सफलतापूर्वक नियोजित किया जा चुका है, जहां नमूने के आसपास तरल की न्यूनतम मात्रा आवश्यक थी28,35. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटोकॉल सभी घुलनशील माइक्रोक्रिस्टल नमूनों पर लागू किया जा सकता है, न कि केवल अच्छी तरह से विवर्तन नमूनों के लिए जो पहले से ही अनुकूलित किए जा चुके हैं। माइक्रोक्रिस्टलाइन सामग्री का उत्पादन करने वाला एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग पारंपरिक रूप से बड़े क्रिस्टल प्राप्त करने के उद्देश्य से अनुकूलन के लिए एक लक्ष्य होगा, हालांकि, यह नमूना तैयारी विधि और वीएमएक्सएम की क्षमताएं आगे अनुकूलन के बिना ऐसे नमूनों से पर्याप्त डेटा एकत्र करने की अनुमति दे सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, यदि इस तरह के माइक्रोक्रिस्टलाइन नमूने खराब होते हैं, तो इस नमूना तैयारी विधि का उपयोग करके वीएमएक्सएम से एकत्र किए गए डेटा अभी भी क्रिस्टलीकरण स्थितियों के आगे अनुकूलन के लिए एक उपयोगी गाइड के रूप में कार्य कर सकते हैं। ग्लो डिस्चार्जिंग और डुबकी फ्रीजिंग सहित ग्रिड तैयार करने के लिए उपकरण अब क्रायोटेम प्रयोगों के लिए सुसज्जित अनुसंधान संस्थानों में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और कई उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध होंगे जो उन्हें वीएमएक्सएम में बीमटाइम के अग्रिम में नमूने तैयार करने में सक्षम करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को जेरेमी Keown, जॉन ग्रिम्स, ज्योफ Sutton और डेव स्टुअर्ट, ऑक्सफोर्ड के स्ट्रूबी विश्वविद्यालय और राहेल बोल्टन, साउथैम्पटन विश्वविद्यालय के विकास और VMXm बीमलाइन के लिए नमूना तैयारी के तरीकों के प्रदर्शन के लिए माइक्रोक्रिस्टल नमूने प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते है बीमलाइन के कमीशन को सक्षम करने के अलावा । लेखक इस पांडुलिपि को प्रकाशित करने में अवसर और समर्थन के लिए iNEXT-डिस्कवरी (परियोजना संख्या 871037) का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
ddH2O | n/a | n/a | |
Ethane gas supply | n/a | n/a | |
Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
Pipette tips | Various | Various | |
Pipetting devices | Various | Various | |
Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |