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Bioquímica

Una pipeline di preparazione del campione per microcristalli presso la linea di fascio VMXm

Published: June 17, 2021
doi:
10.3791/62306
, , , , , ,
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council,Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute,Harwell Science and Innovation Campus

Summary

Il rapporto segnale-rumore dei dati è una delle considerazioni più importanti nell’esecuzione di misurazioni di diffrazione a raggi X da microcristalli. La beamline VMXm fornisce un ambiente a basso rumore e microbeam per tali esperimenti. Qui, descriviamo i metodi di preparazione del campione per il montaggio e il raffreddamento di microcristalli per VMXm e altre linee di cristallografia macromolecolare microfocus.

Abstract

Il montaggio di microcristalli (<10 μm) per la criocristalligrafia a cristallo singolo presenta una sfida non banale. Miglioramenti nella qualità dei dati sono stati osservati per i microcristalli con lo sviluppo di ottiche beamline, stabilità del fascio e messa a fuoco di dimensioni variabili del fascio da submicron a micron, come alla beamline VMXm di Diamond Light Source1. Ulteriori miglioramenti nella qualità dei dati saranno ottenuti attraverso miglioramenti nell’ambiente del campione e nella preparazione del campione. I microcristalli generano intrinsecamente una diffrazione più debole, quindi migliorare il rapporto segnale-rumore è la chiave per raccogliere dati di diffrazione a raggi X di qualità e verrà prevalentemente dalla riduzione del rumore di fondo. Le principali fonti di rumore di fondo a raggi X in un esperimento di diffrazione provengono dalla loro interazione con il percorso dell’aria prima e dopo il campione, dall’eccesso di soluzione di cristallizzazione che circonda il campione, dalla presenza di ghiaccio cristallino e dalla dispersione da qualsiasi altra strumentazione beamline o finestre a raggi X. La beamline VMXm comprende strumentazione e un protocollo di preparazione dei campioni per ridurre tutte queste fonti di rumore.

In primo luogo, un ambiente di campionamento sotto vuoto a VMXm rimuove il percorso dell’aria tra la sorgente di raggi X e il campione. Successivamente, i protocolli di preparazione dei campioni per la cristallografia macromolecolare presso VMXm utilizzano una serie di processi e strumenti adattati da cryoTEM. Questi includono griglie di rame con film di supporto in carbonio bucato, blotting automatizzato e robotica di raffreddamento a tuffo che utilizza etano liquido. Questi strumenti consentono la preparazione di centinaia di microcristalli su una singola griglia crioTEM con un minimo di liquido circostante su un supporto a basso rumore. Inoltre riducono al minimo la formazione di ghiaccio cristallino da qualsiasi liquido rimanente che circonda i cristalli.
Presentiamo il processo per preparare e valutare la qualità dei microcristalli proteici solubili utilizzando la luce visibile e la microscopia elettronica a scansione prima di montare i campioni sulla beamline VMXm per esperimenti di diffrazione a raggi X. Forniremo anche esempi di campioni di buona qualità e quelli che richiedono un’ulteriore ottimizzazione e strategie per farlo.

Introduction

Una delle principali barriere per la determinazione di strutture ad alta risoluzione di molecole biologiche mediante cristallografia macromolecolare (MX) rimane la produzione di cristalli ben diffrattanti a dimensioni variabili. Ci sono molte strategie per raggiungere questo obiettivo, dalla progettazione del costrutto del gene proteico ricombinante fino alle grandi ricerche a matrice sparsa di cocktail chimici che possono generare cristalli iniziali2. Per quest’ultimo, è spesso il caso che il cristallografo dovrà ottimizzare eventuali colpi iniziali per ottenere cristalli con qualità e dimensioni di diffrazione sufficienti per gli studi di determinazione della struttura3. Nonostante queste opzioni, alcune molecole bersaglio potrebbero non generare mai cristalli di grandi dimensioni (>10 μm), ben diffrattanti e di conseguenza il cristallografo deve perseverare con i loro microcristalli e le sfide che tali campioni presentano. Questi includono il montaggio appropriato e la crioprotezione dei cristalli, la gestione della diffrazione intrinsecamente più debole e l’aumento della sensibilità alle radiazioni. I microcristalli sono formati da un minor numero di cellule e molecole unitarie rispetto ai cristalli più grandi e, come tali, la diffrazione non è amplificata nella stessa misura rispetto ai cristalli più grandi, con conseguente intensità di diffrazione intrinsecamente più deboli. È importante che il segnale di sfondo non mascheri questi riflessi, in particolare a una risoluzione più elevata in cui le intensità di riflessione deboli possono essere perse4. Inoltre, i microcristalli sono più sensibili ai danni da radiazioni e nonostante registrino la diffrazione a temperature di azoto liquido5, potrebbe non essere possibile raccogliere dati completi da un singolo cristallo, rendendo necessario raccogliere dati da un numero molto elevato di cristalli per produrre un singolo set di dati completo6.

La crescente disponibilità di laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL) e l’evoluzione dei metodi di cristallografia seriale (SFX)7 hanno fornito percorsi per la raccolta di dati da microcristalli più piccoli. Tuttavia, si tratta di metodi di consegna dei campioni su misura, che richiedono una quantità significativa di competenze hardware e software, in cui gli esperimenti sono limitati alla temperatura ambiente e in genere il consumo del campione è elevato (centinaia di microlitri) e può ancora richiedere un’ulteriore ottimizzazione8. Pertanto, i progetti in cui è possibile fare solo una quantità limitata di microcristalli non sono appropriati per SFX.

Nel frattempo, la tecnologia beamline di sincrotrone negli ultimi decenni è progredita per produrre fasci più piccoli e più stabili9 con una brillantezza che ha permesso la raccolta di dati da cristalli sempre più piccoli10,11. Linee di fascio di microfocus come FMX a NSLS-II e I24 a Diamond Light Source sono state in grado di determinare nuove strutture da cristalli con dimensioni massime di ~ 3 μm12 e dimostrare la capacità di raccogliere dati utilizzabili da cristalli ancora più piccoli che misurano ~ 1 μm13. La beamline deve essere configurata con precisione, con un’eccellente ottica di visualizzazione dell’asse ad alta risoluzione, una sfera di confusione minima per la rotazione del campione e un asse di rotazione allineato con precisione che coincide con il fascio di raggi X. È importante abbinare strettamente il profilo del fascio di raggi X al volume del cristallo e assicurarsi che il cristallo sia allineato con precisione nel fascio di raggi X – una sfida per i cristalli <5 μm14. Soddisfare queste condizioni sperimentali sulla linea del fascio è essenziale per registrare i dati della migliore qualità dai microcristalli.

L’aspetto rimanente e forse più importante della raccolta dei dati dai microcristalli è la presentazione del cristallo al fascio di raggi X. I microcristalli sono stati spesso montati su supporti per campioni in micromesh, fabbricati in poliimmide, un materiale a bassa dispersione di raggi X con aperture fino a 10 μm15,16. La rete in poliimmide è montata su un perno standard che è inserito in una base magnetica SPINE, rendendola compatibile con la maggior parte delle linee di fascio MX17. Il supporto a rete viene utilizzato per pescare i cristalli dalla goccia di cristallizzazione spesso seguendo la stessa procedura di montaggio di un cristallo da 100 μm utilizzando un supporto standard in stile loop. Mentre i cristalli possono essere distribuiti attraverso la rete, uno svantaggio chiave è che un volume relativamente grande di liquido può essere trasportato dalla rete e dal perno durante la raccolta (Figura 1C, D). Questo volume di liquido, che può essere molte volte più grande dei cristalli stessi, contribuirà al rumore di fondo quando illuminato con raggi X. Questa dispersione di fondo può essere ancora più forte se il liquido forma ghiaccio cristallino durante il raffreddamento del flash, diminuendo il rapporto segnale-rumore di intensità già deboli all’interno delle risoluzioni della diffrazione del ghiaccio. Pertanto, è fondamentale che il liquido in eccesso venga rimosso dal campione, per garantire che tutti i possibili segnali possano essere registrati. Questa sfida è ancora maggiore nel caso dei cristalli proteici di membrana formati all’interno della fase cubica lipidica (LCP), dove l’LCP genera una forte dispersione di fondo ed è anche difficile da rimuovere da intorno ai cristalli 18.

La nuova beamline VMXm (Versatile Macromolecular Crystallography microfocus) presso Diamond Light Source fornisce le condizioni con cui raccogliere dati da cristalli potenzialmente di dimensioni inferiori a un micron. La beamline è stata progettata per fornire un profilo del fascio di 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, un goniometro con una sfera di confusione non superiore a 60 nm e un ambiente campione in vacuo. Queste caratteristiche di progettazione della stazione finale VMXm riducono al minimo la generazione di rumore di fondo a raggi X da parte dell’apparato beamline durante la raccolta dei dati con la più grande fonte rimanente di sfondo generata dal campione14.

Specifici metodi di preparazione dei campioni progettati per la beamline VMXm offrono l’opportunità di ridurre questo background e migliorare ulteriormente il rapporto segnale-rumore dei dati di diffrazione, massimizzando la qualità dei dati che possono essere registrati da microcristalli che misurano < 10 μm. Molti dei requisiti qui descritti per la diffrazione a basso fondo da microcristalli sono comuni anche alla microscopia elettronica a trasmissione criogenica (cryoTEM)19 e alla diffrazione elettronica microcristallica (microED)20. Di conseguenza, molti degli strumenti che sono già stati sviluppati per la preparazione di campioni crioTEM sono adatti, con alcuni adattamenti, per la preparazione di microcristalli. Nella preparazione di campioni per crioTEM a singola particella, le particelle in esame sono incorporate in strati molto sottili (tipicamente <100 nm) di ghiaccio vitreo in modo tale che gli elettroni siano in grado di trasmettere attraverso il campione. Il sottile strato uniforme si ottiene cancellando il liquido in eccesso e la vetrificazione del campione si ottiene mediante un rapido raffreddamento del campione (~104 K s-1)21 attraverso l’immersione nell’etano liquido tenuto a ~ 93 K22. Al contrario, l’azoto liquido, come usato abitualmente per la preparazione del campione MX, è un criogeno meno efficiente dell’etano e ha una maggiore propensione alla formazione di ghiaccio cristallino all’interno del campione21. La formazione di ghiaccio cristallino, che può degradare la diffrazione e generare rumore di fondo, è normalmente mitigata attraverso l’uso di composti crio-protettivi23. Polimeri a basso peso molecolare come il poli-etilenglicole (PEG) 400 e il metil-2,4-pentanediolo (MPD), zuccheri, oli o sali saturi possono essere aggiunti a un’aliquota di soluzione di cristallizzazione in basse concentrazioni24– non esiste una soluzione “taglia unica” per selezionare il crioprotettore più appropriato e questo spesso richiede ottimizzazione25 . Il cristallo subisce anche molteplici manipolazioni durante il processo di raccolta e crioprotezione che possono causare danni al cristallo, l’opportunità di utilizzare etano liquido consente l’omissione di questo passaggio e aiuta a proteggere l’integrità del cristallo.

Mentre l’etano liquido è un criogeno efficace per i microcristalli (<10 μm) a causa della sottigliezza del campione, esistono metodi alternativi per prevenire la formazione di ghiaccio cristallino, in particolare nei cristalli più grandi, tra cui la riduzione del contenuto di acqua del cristallo mediante l'uso di un ambiente umido strettamente controllato26o attraverso l’assorbimento del liquido in eccesso lontano sia dal loop che dalla superficie del cristallo27 , tuttavia, anche questi richiedono una maggiore manipolazione del campione. L’uso del blotting automatizzato e del congelamento a tuffo con etano liquido, come in cryoTEM, insieme rimuovono la soluzione di cristallizzazione in eccesso e forniscono un mezzo per far lampeggiare i microcristalli freddi in modo controllato, tentando di ridurre al minimo la manipolazione.

Qui, presentiamo un protocollo che può essere utilizzato non solo da entrambi gli utenti della beamline VMXm e da altre beamline microfocus per raccogliere dati di diffrazione segnale-rumore elevati, ma può anche essere utile a coloro che preparano campioni di cristalli proteici solubili e cristalli proteici a membrana a base di detergente per esperimenti microED. Mentre tutte le strutture per preparare e valutare i campioni sono disponibili presso VMXm, molti laboratori di biologia strutturale sono sempre più attrezzati per la preparazione di campioni crioTEM. Di conseguenza, prevediamo che alcuni utenti potrebbero voler utilizzare le proprie strutture per preparare i loro campioni per il beamtime su VMXm.

Protocol

1. Configurazione dell’apparecchiatura NOTA: I metodi qui descritti utilizzano uno strumento di congelamento a tuffo con un singolo braccio di blotting. Alcuni strumenti sono dotati di due bracci di blotting e consigliamo all’utente di controllare le istruzioni del produttore per regolare lo strumento in modo che sia in uso un solo braccio di blotting. Assicurarsi che un microscopio ottico sia posizionato vicino allo strumento di congelamento a tuffo, idealmente in modo che sia il microscopio che il congelatore a immersione siano facilmente raggiungibili dall’utente. Impostare e raffreddare il congelatore a immersione automatica secondo le istruzioni del produttore.NOTA: la temperatura della camera del campione deve essere impostata sulla temperatura alla quale sono stati coltivati i cristalli. Non posizionare carta assorbente nella camera del campione.ATTENZIONE: L’etano liquido è un esplosivo altamente infiammabile e deve essere utilizzato solo in un’area ben ventilata lontano da potenziali fonti di scintille. Etichettare le scatole della griglia in modo appropriato e raffreddarle in un piccolo dewar usando azoto liquido. Posizionare con attenzione le griglie, lato pellicola di carbonio verso l’alto, su un supporto appropriato per la scarica del bagliore (come un vetrino per microscopio avvolto in parafilm). Griglie crioTEM a scarica luminosa per 25 s a 0,39 mBar, utilizzando una corrente di 15 mA. Scarica glow poco prima che vengano utilizzate le griglie. Tenere le griglie scaricate dal bagliore in una capsula di Petri coperta fino al momento; se 30 minuti sfasano dopo la scarica del bagliore, ripetere la scarica del bagliore.NOTA: con il congelatore a immersione pronta e le griglie preparate, l’attenzione può rivolgersi al campione. 2. Determinazione dei parametri iniziali di blotting Impostare l’umidità relativa della camera del campione al 90% e il tempo di blotting a 5 s e assicurarsi che il congelatore a immersione sia impostato per immergere automaticamente il campione al termine del blotting.NOTA: Questi parametri di partenza sono più adatti per il congelatore a tuffo Leica GP, altri parametri come la forza di blotting sono disponibili sul FEI Vitrobot. Tuttavia, nella nostra esperienza l’integrità del cristallo è più probabile che venga mantenuta dall’uso di un singolo braccio di blotting. Per poter sigillare il vassoio di cristallizzazione una volta aperto il pozzo di interesse, tagliare una piccola striscia di nastro adesivo e piegare su un’estremità per creare una linguetta per facilitare l’apertura del sigillo e posizionare con cura su un lato. Tagliare il sigillo sopra il pozzo di cristallizzazione, incluso il serbatoio. Lavorando rapidamente, applicare 2-5 μL di soluzione di serbatoio alla goccia contenente il cristallo per mantenere il volume del liquido nella goccia. Utilizzare la linguetta del nastro per poi richiurare il pozzo e assicurarsi che la goccia di cristallizzazione non si asciughi. Tenendo momentaneamente aperto il nastro sopra il pozzetto di cristallizzazione, trasferire 10 μL della soluzione del serbatoio in un tubo da 0,5 mL da utilizzare per le fasi successive. Risigillare il pozzo. Posizionare un pezzo di carta assorbente pretagliata sul braccio di blotting dello strumento di congelamento a tuffo. Posizionare una singola griglia di scarico a bagliore nella pinna di congelamento a tuffo e caricare nello strumento in modo tale che il lato in carbonio sia rivolto lontano dal braccio di blotting. Assicurarsi che l’umidità relativa all’interno della camera di blotting sia al 90%. Ruotare la pinna in modo che il lato del film di carbonio sia rivolto verso il braccio di blotting. Utilizzando una pipetta da 2,5 μL, applicare 2 μL di soluzione di serbatoio dal tubo da 0,5 mL al lato non di supporto (rame lucido) della griglia crioTEM. Ruotare la griglia in modo che il lato di supporto in carbonio sia rivolto lontano dal braccio di blotting e ripetere il processo, applicando con attenzione il liquido sul lato di supporto del film di carbonio della griglia. Evitare di toccare il film di carbonio con la punta della pipetta in modo da non danneggiare il film di carbonio. Il liquido dovrebbe diffondersi attraverso la griglia a causa della carica depositata durante la scarica del bagliore. Avviare il processo di blotting osservando la griglia. Un cannocchiale di visualizzazione è disponibile sulla Leica GP2 per questo scopo. Osserva se il liquido viene prelevato dalla superficie di carbonio della griglia durante questo periodo, questo inizia con la maggior parte del bolo liquido sulla griglia che si appiattisce mentre il liquido viene malvagio attraverso la griglia. Man mano che il liquido in ogni quadrato della griglia viene ulteriormente ridotto, si può osservare un’ondata di “scoppio” attraverso la superficie della griglia. Se si osserva questo effetto, il blotting può essere interrotto entro 2-3 s dalla fine dell’effetto popping. Non è necessario immergere la griglia di prova che può essere scartata. Se il cosiddetto effetto “popping” non viene osservato, ripetere i passaggi 2.11-2.14, estendendo ogni volta il tempo di blotting di 1-2 s fino a quando l’effetto popping non viene osservato poco prima che il braccio di blotting si ritragga dalla griglia. Si noti questa volta per il passaggio 3.NOTA: è importante che il blotting si fermi non appena si è verificato questo effetto scoppiettante per garantire che durante il processo, i cristalli non si disidratino a causa dell’over-blotting. Utilizzare la soluzione di cristallizzazione dal serbatoio per il back blotting e la diluizione del campione, in quanto garantisce che i cristalli siano soggetti a una soluzione coerente, riducendo il rischio di destabilizzare i cristalli. 3. Raccolta dei cristalli Posizionare la piastra di cristallizzazione sotto il microscopio ottico e posizionare il bersaglio ben all’interno del campo visivo. Posizionare una griglia fresca e luminosa nella pinna del congelatore a tuffo e montare la pinna nel congelatore a tuffo, con il lato del film di carbonio rivolto lontano dal braccio di blotting. Ruotare la pinna in modo che il lato del film di carbonio sia rivolto verso il braccio di blotting. Utilizzando una pipetta da 2,5 μL, applicare 2 μL di soluzione di serbatoio dal tubo da 0,5 mL al lato non di supporto della griglia crioTEM e ruotare la griglia in modo che il lato di supporto del film di carbonio sia rivolto verso la porta del campione del congelatore a immersione. Staccare la guarnizione temporanea e con la pipetta impostata a 2 μL, aspirare delicatamente la goccia di cristallizzazione ripetutamente per sospendere i microcristalli (è importante non introdurre bolle d’aria alla goccia).NOTA: È fondamentale osservare questo processo al microscopio ottico per garantire che i cristalli vengano rilasciati da qualsiasi pelle superficiale o dalla base del pozzo. Se i cristalli sono bloccati e non disegnati con l’aspirazione, sia la punta della pipetta che altri strumenti di cristallizzazione come un ago per agopuntura, possono essere utilizzati per rimuovere delicatamente i cristalli. A seconda delle dimensioni dei cristalli e della profondità di campo del microscopio ottico, a volte è possibile visualizzare, utilizzando il microscopio, i cristalli che entrano nella punta della pipetta. Trasferire 2 μL del liquame microcristallino aspirato al congelatore a tuffo e applicare tutto il campione sul lato carbonio della griglia crioTEM. Tamponare per il tempo determinato nel passaggio 2 e avviare immediatamente il congelamento a immersione. Durante il blotting, osserva il verificarsi di un effetto onda scoppiettante attraverso la griglia e nota se ciò si è verificato completamente attraverso la griglia. La presenza di cristalli può influenzare il tempo di blotting iniziale e potrebbe essere necessario regolare per le griglie successive di 1-2 s. Lavorando rapidamente, trasferire la griglia dall’etano liquido alla scatola della griglia immersa nell’azoto liquido. L’etano residuo può trasformarsi in un solido bianco opaco sulla griglia quando entra nell’azoto liquido. Per ridurre questo, rimuovere la griglia costantemente dall’etano liquido, quindi trasferire rapidamente al serbatoio di azoto liquido. Una volta che 4 griglie sono state posizionate nella scatola della griglia, fissare il coperchio della scatola con la vite e trasferirlo in una schiuma dewar di azoto liquido per consentire un’ulteriore valutazione del campione con un microscopio elettronico a scansione (SEM) o in un dewar di stoccaggio di azoto liquido utilizzando un contenitore di stoccaggio appropriato. 4. Valutazione della densità del campione mediante microscopia ottica ATTENZIONE: questo metodo è distruttivo. Se la disponibilità del campione è limitata, ad esempio solo una o due goccioline di cristallizzazione, si consiglia di saltare questo passaggio. Dopo il congelamento dei campioni (fase 3.7) è possibile valutare la distribuzione dei cristalli attraverso la griglia. Montare una griglia crioTEM asciutta a temperatura ambiente nella pincietta del congelatore a immersione e posizionare la pinca su un lato sul microscopio ottico, con la griglia nel campo visivo. Impostare un ingrandimento e una messa a fuoco appropriati in modo che l’intera griglia e i singoli quadrati della griglia possano essere risolti. Seguire i passaggi 3.1-3.7. Invece di trasferire la griglia alla scatola della griglia (passaggio 3.8), ritrarre la griglia immersa dall’etano liquido ripristinando il congelatore a immersione.ATTENZIONE: la griglia e il campione si riscaldano a temperatura ambiente e non possono essere utilizzati per ulteriori esperimenti di diffrazione. Rimuovere la pinp dallo strumento di congelamento a tuffo. Mentre si tiene la griglia all’interno della pinca, posizionare la griglia sotto il microscopio ottico – la messa a fuoco sarà già impostata approssimativamente. Esegui una messa a fuoco fine e valuta la densità dei cristalli attraverso la griglia. Una buona griglia conterrà diversi cristalli isolati lontano dalle barre della griglia all’interno di ciascun quadrato della griglia e l’aggregazione dei cristalli è minima. Se la densità dei cristalli all’interno della griglia provoca l’aggregazione di cristalli con solo pochi cristalli isolati, diluire ulteriormente il liquame cristallino con la soluzione del serbatoio e ripetere la fase 3. Fare attenzione quando si diluiscono i campioni in modo che la diluizione non comporti la dissoluzione dei cristalli. Diluire i cristalli a gradini utilizzando piccoli volumi di 0,5-1 μL. 5. Valutazione del campione mediante microscopia elettronica a scansione NOTA: La preparazione del microcristalli su griglie crioTEM è meglio valutata con una microscopia elettronica a scansione (SEM) in condizioni criogeniche, questo può essere ottenuto con un SEM dotato di uno stadio criogenico. Al VMXm, viene utilizzato un JEOL JSM-IT100 SEM (sorgente di tungsteno) con una serratura d’aria Quorum PP3006 e criostadio. Per garantire danni minimi da radiazioni durante la visualizzazione di campioni su VMXm28,29, vengono utilizzate le seguenti impostazioni: tensione di accelerazione di 5 kV; una dimensione spot di 40 (unità arbitrarie sul JEOL JSM-IT100); Distanza di lavoro di 10 mm. Le immagini vengono registrate utilizzando il rivelatore di elettroni secondario, per l’allineamento del campione e la messa a fuoco viene utilizzato un tempo di permanenza di 0,8 μs mentre le immagini ad alta risoluzione di singoli cristalli vengono catturate utilizzando un tempo di permanenza di 16 μs. È importante prima di caricare un campione nel SEM che il microscopio sia allineato secondo le istruzioni del produttore. Si consiglia di caricare nel SEM solo una singola griglia mentre le griglie rimanenti preparate con gli stessi parametri sono riservate agli esperimenti di diffrazione a raggi X. Preparare il SEM raffreddando lo stadio crio-campione a -180 °C secondo le istruzioni del produttore. Seguire le istruzioni per il caricamento delle griglie cryoTEM nel sistema specifico disponibile. Con il campione caricato nel SEM, accendere il fascio di elettroni, allineare il campione e impostare la messa a fuoco utilizzando un ingrandimento elevato (tempo di permanenza di 0,8 μs). Innanzitutto, eseguire la valutazione iniziale con l’intera griglia in vista a basso ingrandimento (x45). Registrare un’immagine con questo ingrandimento. Aumentare l’ingrandimento per consentire un’ispezione più ravvicinata dei singoli quadrati della griglia, i singoli cristalli dovrebbero essere osservabili molto chiaramente. Muoviti intorno alla griglia, catturando immagini fisse (tempo di permanenza di 16 μs) di cristalli assicurandoti che soddisfino i seguenti requisiti prima di procedere: Assicurarsi che le griglie siano piatte e che il film di supporto in carbonio sia in gran parte intatto. Assicurarsi che ci siano numerosi cristalli singoli con uno stretto alone di liquido vetrificato che circonda il cristallo. Assicurarsi che i fori nel film di supporto in carbonio siano visibili. Assicurarsi che non vi siano grandi regioni di liquido vetrificato come definito da un aspetto scuro e liscio. Assicurarsi che ci sia poco o nessun ghiaccio esagonale o ghiaccio superficiale sparso sulla griglia. Assicurarsi che i cristalli siano distribuiti uniformemente nella pellicola di supporto e non si sovrappongano. A questo punto, misurare con precisione le dimensioni di un certo numero di cristalli per consentire un’accurata correlazione delle dimensioni del fascio di raggi X durante i successivi esperimenti di diffrazione. I campioni che possono essere recuperati in modo affidabile dal SEM e mantenuti a temperature criogeniche possono essere successivamente utilizzati per esperimenti di diffrazione a raggi X. Se ciò non è possibile, smaltire questi campioni.NOTA: durante l’imaging sia dell’intera griglia che dei singoli microcristalli (circa ingrandimento x45 e x700 rispettivamente), è necessario valutare se procedere alla beamline con griglie preparate utilizzando gli stessi parametri o se alcuni parametri potrebbero dover essere regolati durante il passaggio 3. Le griglie devono soddisfare i test descritti al punto 5.5. Se le griglie non soddisfano questi criteri, è necessaria un’ulteriore ottimizzazione durante il passaggio 3 prima di ripetere il passaggio 5. 6. Preparazione della griglia per esperimenti di diffrazione presso VMXm Raffreddare il numero richiesto di portaes campioni VMXm (Figura 4A) (fino a 5) caricati nella cartuccia del campione (con coperchio) con il caricatore di campioni in un grande dewar di schiuma (Figura 4B) utilizzando azoto liquido – questo può richiedere un grande volume di azoto liquido. Il livello di azoto liquido deve essere appena al di sopra della posizione del campione sul caricatore del campione. Preparare circlip e strumenti. Posizionare gli strumenti, tra cui lo strumento di ritaglio, la pince e la pince campione VMXm, nei fori del caricatore del campione per raffreddare. Può essere utile organizzare un riflettore sopra il dewar. Trasferire rapidamente la scatola della griglia contenente le griglie caricate con microcristalli nella rientranza della scatola della griglia sul caricatore del campione e svitare il coperchio in modo che sia sciolto e ruotabile (non rimuovere). Sotto azoto liquido rimuovere il coperchio dalla cartuccia campione con una pinciglia grande e posizionarlo sotto il caricatore del campione. Utilizzare la pinza di campionamento VMXm per sollevare il portaes campioni sul caricatore di campioni, assicurandosi che il supporto sia rivolto verso l’alto in modo che possa accettare una griglia. Quando si trova nella posizione corretta, un piccolo perno sul caricatore del campione si innesterà con il piccolo foro al centro del porta campioni. Con la pinza fine raffreddata, sollevare con attenzione la griglia dalla scatola della griglia e trasferirsi vicino all’apertura della griglia sul supporto del campione. Ruota la griglia in modo che sia piatta (non importa da che parte sia rivolto il lato della pellicola di supporto). Abbassare delicatamente la pince in modo che la griglia sia il più vicino possibile sopra l’apertura della griglia (fare attenzione a non piegare la griglia) e rilasciare la griglia nell’apertura. Se la griglia non si posiziona correttamente, utilizzare con attenzione la pinaccia fine per spingere la griglia in posizione o toccare delicatamente il porta campioni con la pinaccia più grande. Posizionare rapidamente lo strumento circlip pre-raffreddato sulla griglia nell’apertura della griglia e posizionare il circlip premendo il pulsante. Può essere utile applicare 2 depressioni del pulsante per assicurarsi che il circlip sia correttamente seduto. Ricaricare l’azoto liquido in modo che il livello sia ~ 1,5 cm sopra il porta campioni. Utilizzando la pinza di campionamento VMXm, sollevare con attenzione il supporto del campione caricato su e sopra il piccolo perno sul caricatore del campione e di nuovo nella cartuccia del campione. Prendere nota del numero di posizione del porta campione nella cartuccia del campione. Continuare a caricare le griglie nei portase campioni fino a quando tutti i campioni non vengono caricati. Restituire le scatole della griglia al dewar di stoccaggio se i campioni rimangono all’interno e rimuovere il caricatore di campioni dal dewar per creare più spazio. Sostituire il coperchio della cartuccia sulla cartuccia, assicurandosi che il perno sulla parte superiore della cartuccia si innesti con il foro nel coperchio. Raffreddare e riempire il dewar airlock VMXm con azoto liquido e posizionarlo accanto al dewar in schiuma contenente la cartuccia campione caricata. Utilizzando lo strumento cartuccia VMXm, innestare con attenzione l’utensile nelle creste sul lato della cartuccia e sollevare rapidamente la cartuccia nel dewar airlock. Assicurarsi che il livello di azoto liquido copra la cartuccia. Posizionare il coperchio sull’airlock dewar e procedere alla stazione finale VMXm con la cartuccia campione caricata.NOTA: il caricamento della cartuccia campione nella stazione finale VMXm verrà eseguito dal personale beamline.

Representative Results

Lo scopo di questo protocollo è quello di ottenere microcristalli vetrificati con un volume minimo di liquido che circonda il cristallo che consentono esperimenti di diffrazione a raggi X con dispersione di fondo minima per migliorare il segnale di diffrazione. Immagini SEM di esempio di microcristalli preparati su griglie crioTEM per una dispersione di fondo minima sono mostrate in Figura 1A, B e Figura 2. Le griglie con singoli cristalli distribuiti uniformemente forniranno l’uso più efficiente della rete, con un buon segnale-rumore. Tuttavia, questo di solito non è possibile in tutta la griglia e alcune regioni possono mostrare una certa quantità di aggregazione (Figura 2A, B). Nonostante questo raggruppamento, questi esempi mostrano ancora un numero utile di singoli cristalli isolati che forniranno una diffrazione a basso sfondo (Figura 5). Il livello di blotting che mantiene ancora una dispersione a basso sfondo può variare. Forte blotting tale che i fori nel film di supporto in carbonio sono chiaramente visibili ma i cristalli rimangono idratati è l’obiettivo (Figura 2C,D). Tuttavia, le griglie di buona qualità possono ancora visualizzare del liquido all’interno dei fori della pellicola di supporto, sebbene la posizione dei fori dovrebbe essere ancora identificabile (Figura 2A, B). È importante sottolineare che tutti questi esempi mostrano cristalli singoli e isolati con un alone vetrificato di liquido che circonda il cristallo per mantenere l’idratazione tra il blotting e il congelamento a tuffo. Molti campioni possono richiedere un’ulteriore ottimizzazione (Figura 3), che può includere la variazione del tempo di blotting o la concentrazione dei microcristalli. Le griglie sovraccariche di cristalli dimostreranno una ridotta efficienza di blotting e possono comportare la registrazione di più reticoli in singole immagini di diffrazione (Figura 3A, B). Condizioni di cristallizzazione più viscose, come quella per la tripsina che contiene l’8% di PEG 4000 e il 15% di glicole etilenico(Figura 3C),possono comportare la necessità di tempi di blotting più lunghi (>10 s). Al contrario, le condizioni di cristallizzazione con viscosità molto bassa che si macchiano molto rapidamente, possono soffrire di problemi di distribuzione dovuti alla gravità che causano l’assestamento prima che si verifichi il blotting, con conseguente sedimentazione di tutti i microcristalli lungo un lato della griglia (Figura 3D). La preparazione ottimale dei campioni consente di sfruttare tutte le capacità di VMXm per raccogliere dati di diffrazione a raggi X di alta qualità alla massima risoluzione possibile con elevato rapporto segnale-rumore (Figura 5). Questi campioni traggono vantaggio dall’essere compatibili con l’ambiente di campionamento in-vacuo, con conseguente conteggio medio dello sfondo molto basso o nullo nelle immagini di diffrazione. L’uso di etano liquido, senza crio-protettivo, si traduce in un’assenza di anelli di ghiaccio (Figura 5), anche se dove i cristalli si trovano vicino alle barre della griglia di rame, il fascio di raggi X può dare un’occhiata alle barre con conseguente anelli di diffrazione della polvere di rame a ~ 2,1 Å e ~ 1,8 Å. Figura 1: Confronto tra montaggio microcristallino su supporti micromesh e griglie cyoTEM. Micrografie elettroniche a scansione di microcristalli congelati a tuffo di virus poliedrico che misurano 2,5 μm attraverso (A, B) 5 kV di tensione accelerata, una dimensione spot di 39 (unità arbitrarie) e un tempo di permanenza di 16 μs. La griglia è priva di liquido in eccesso (A), si osserva uno stretto alone di liquido che circonda i cristalli (B). Gli stessi campioni montati su una micromesh (aperture di 20 μm) prima del raffreddamento flash in azoto liquido e osservati utilizzando il sistema di visualizzazione sull’asse alla beamline I24 face-on (C) e laterale su (D). Le distorsioni ottiche (C) durante la visualizzazione frontale danno un’indicazione dell’estensione dello spessore del liquido attraverso la micromesh, questo è più chiaro quando si visualizza il micromesh side-on (D). Il bersaglio rosso in C e D rappresenta la posizione e le dimensioni del fascio di raggi X. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Esempi di campioni di buona qualità. Cristalli di poliedri (A) osservati attraverso un singolo quadrato di griglia ~ 100 μm. Mentre alcuni dei cristalli sono leggermente raggruppati e mostrano una certa connettività del liquido circostante, ci sono un certo numero di cristalli singoli isolati con un piccolo alone di liquido che circonda il cristallo. Anche i cristalli di insulina leggermente più grandi (B) che misurano ~ 5 x 5 μm mostrano alcuni raggruppamenti, ma ancora una volta ci sono singoli cristalli ben isolati. I cristalli ad ago possono avere una dimensione molto stretta e richiedono un microfascio, come questi cristalli di lisozima a forma di ago (C). Una stretta fascia di liquido può essere vista intorno a questi cristalli (alone grigio chiaro). Microcristalli più grandi fino a decine di micron possono anche essere ben montati su griglie crioTEM, come questi cristalli di proteinasi K ~ 7 μm (D). Sia in (C) e (D) che in misura minore in (A), i fori del film di supporto in carbonio sono chiaramente visibili, dimostrando la presenza di pochissimo / nessun liquido. Nell’esempio B, mentre non si osservano fori vuoti, la posizione dei fori può ancora essere identificata, indicando che il liquido sta solo riempiendo i fori nel film di supporto. In tutti questi esempi, un alone di liquido può essere visto attorno al bordo del quadrato della griglia (un quadrato interno arrotondato), dove i fori hanno un aspetto grigio più chiaro. Questa è una caratteristica comune delle griglie ben preparate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Esempi di campioni che richiedono un’ulteriore ottimizzazione. Griglie sovraccariche di microcristalli (A, B) possono aumentare la dispersione di fondo poiché i campioni bloccano i fori nel film di supporto riducendo l’efficienza di blotting e con una maggiore tensione superficiale tra i cristalli rimane più liquido. Oltre a un degrado del rapporto segnale-rumore con conseguente perdita di informazioni, è probabile che vengano registrati più reticoli. L’utilizzo di un tempo di blotting non abbastanza lungo o di una soluzione di cristallizzazione altamente viscosa può risultare in un campione eccessivamente bagnato(C),producendo anche un basso rapporto segnale-rumore. Le condizioni di cristallizzazione senza precipitanti, come quelle per l’insulina bovina (D), hanno una viscosità molto bassa. Mentre questo si traduce in un tempo di blotting molto breve, può anche provocare il movimento dei cristalli attraverso la griglia prima e durante il blotting a causa degli effetti della gravità. Questo di solito si traduce in una griglia in gran parte vuota con un’alta concentrazione di cristalli lungo un bordo (D). Può essere vantaggioso aggiungere un agente viscoso come il glicole etilenico al liquame cristallino poco prima di applicarli alla griglia per ridurre il flusso cristallino e migliorare la distribuzione dei cristalli. Questo può anche allungare il tempo di blotting, rendendo più facile osservare il blotting. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Strumenti per il caricamento dei campioni in VMXm. Un set di strumenti su misura è stato progettato per caricare i portaes campioni VMXm (A). Il caricatore di campioni (B) ha spazio per un singolo porta campioni VMXm, una griglia e lo stoccaggio degli utensili durante il lavoro. È inoltre progettato per consentire di lavorare appena sotto la superficie dell’azoto liquido e consentire alla cartuccia campione di adattarsi sotto (B). L’airlock dewar (C), che si adatta alla scatola del gas di azoto airlock sulla stazione finale VMXm, viene utilizzato per portare la cartuccia campione caricata dal laboratorio alla gabbia sperimentale beamline. Per visualizzare i campioni nel SEM offline, è stata effettuata una navetta su misura (D) comprendente il portaes campioni VMXm senza base per consentire la valutazione nel supporto del campione utilizzato sulla beamline. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Esempio di diffrazione da microcristalli in VMXm. Una singola immagine di diffrazione registrata utilizzando un rivelatore Pilatus 3 6M al VMXm di un cristallo poliedrico virale ~ 3 μm montato su una griglia crioTEM utilizzando il metodo di congelamento a tuffo. La diffrazione è osservata oltre 1,7 Å e una riflessione (quadrato blu) a 1,74 Å è inserita, dimostrando la bassa dispersione di fondo, con un alto numero di pixel con conteggi zero. Il glicole etilenico ad una concentrazione finale del 50% v/v è stato aggiunto al liquame cristallino prima di applicarlo alla griglia. La natura di sfondo basso della posizione del campione VMXm è dimostrata dallo sfondo costante attraverso l’immagine, come mostrato dalle intensità tracciate sotto la linea tratteggiata blu, anche vicino al centro del fascio. Le intensità tracciate mostrano che lo sfondo rimane al di sotto di 3 conteggi. Due deboli anelli sono osservati a 2,15 Å e 1,86 Å che sono generati dalla diffrazione della polvere del rame della griglia crioTEM. Non ci sono anelli di ghiaccio rilevabili, dimostrando l’efficacia del blotting seguito dal raffreddamento con etano liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo dimostra come gli strumenti della preparazione del campione crioTEM possono essere utilizzati per la preparazione di microcristalli per esperimenti di diffrazione a raggi X su linee di fascio di microfocus. La strumentazione standard della beamline è centrata attorno a un campione montato su pin e mentre sono stati compiuti sforzi per fornire un supporto del campione su questi supporti per microcristalli, sono spesso difficili da caricare con il campione garantendo al contempo che venga raggiunto il massimo rapporto segnale-rumore (Figura 1C, D). Molti di questi campioni possono anche richiedere l’ottimizzazione delle condizioni di crioprotezione per garantire che il campione sia vitreo. Il metodo di congelamento a tuffo fornisce un modo ripetibile per rimuovere il liquido in eccesso e raffreddare il campione in un criogeno efficiente (Figura 1A, B). Mentre la griglia può quindi essere montata su una beamline standard con un pin basato su pin, i portaes campioni VMXm sono stati specificamente progettati per accettare griglie e mantenerle al di sotto della temperatura di transizione vetrosa in un ambiente di vuoto tramite raffreddamento conduttivo. L’ambiente di campionamento di VMXm consente una raccolta di dati in background basso, in cui il campione è la fonte rimanente di sfondo, e fornisce un microfascio che può essere utilizzato per abbinare cristalli con dimensioni inferiori a 10 μm. Questo metodo di preparazione del campione può anche essere utilizzato per preparare nanocristalli per la diffrazione elettronica dove c’è anche bisogno di pochissimo liquido in eccesso e un campione vitreo a causa della debole penetrazione degli elettroni. Mentre le griglie crioTEM sono fragili, quelle esperte nella raccolta di cristalli in loop si adatteranno rapidamente alla gestione delle griglie. Con una piccola quantità di esperienza, poche griglie andranno perse durante le fasi di blotting, congelamento e caricamento del protocollo. Le fasi di ottimizzazione sono, tuttavia, fondamentali per questo successo e un’attenta preparazione ridurrà le possibilità di perdere cristalli o ridurre l’integrità del cristallo.

Le griglie CryoTEM forniscono un singolo supporto relativamente grande che può contenere molte centinaia di cristalli, migliorando così la produttività in cui potrebbe essere possibile registrare solo un piccolo cuneo di dati di diffrazione. Una singola griglia può anche fornire abbastanza cristalli per determinare la struttura proteica, in particolare nei cristalli di alta simmetria. Laddove solo una o due singole gocce di cristallizzazione hanno generato microcristalli, il solo blotting di prova della condizione di cristallizzazione può aiutare a garantire che quando i microcristalli sono cancellati, i tempi utilizzati siano il più vicino possibile a quelli necessari per generare campioni iniziali di buona qualità. I supporti in film di carbonio sono invisibili ai raggi X e sono disponibili con diverse spaziature tra i fori, che possono essere utilizzate per adattarsi a una particolare morfologia. Più comunemente utilizziamo film di supporto con fori da 2 μm a una spaziatura di 2 μm, ma fori più piccoli con una maggiore spaziatura possono essere più appropriati per cristalli più piccoli di 2 μm. Sono disponibili altri film di supporto come quelli con fori da 1 μm con una spaziatura di 4 μm e film di supporto con fori di forma diversa, che influenzeranno il tempo di blotting. Una dimensione della maglia quadrata della griglia di 200 (200 quadrati per pollice) fornisce anche spazio sufficiente (~ 100 μm) tra le barre della griglia di rame in modo che il fascio di raggi X non interagisca fortemente con il rame fornendo al contempo un supporto strutturale sufficiente per il film di carbonio caricato con cristalli. L’uso di etano liquido annulla la necessità di crioprotezioni, che a sua volta riduce il requisito sul volume del campione che sarebbe stato utilizzato nell’ottimizzazione delle condizioni di crioprotezione.

I principali parametri da ottimizzare durante il processo sono i tempi di blotting e la diluizione del campione. I tempi di blotting dovrebbero essere abbastanza lunghi da osservare l’effetto “popping” su tutta la griglia prima di immergersi nel congelamento. L’over blotting potrebbe causare la disidratazione dei cristalli, tuttavia, il controllo dell’umidità all’interno della camera del campione viene utilizzato per ridurre al minimo questo effetto. Mentre si suggerisce che un’umidità relativa del 90% utilizzata, alcuni campioni possono beneficiare dell’ottimizzazione dell’umidità. L’umidità può influire sull’efficienza di blotting della carta assorbente che può lentamente saturare di acqua. Inoltre, il controllo dell’umidità all’interno della camera del campione potrebbe essere utilizzato per migliorare la qualità della diffrazione deicristalli 30. Si raccomanda di apportare piccole modifiche (<5%) all'umidità prima di verificare l'integrità della diffrazione per garantire che la qualità della diffrazione non sia degradata.

L’ottimizzazione di campioni non preziosi può essere condotta utilizzando un microscopio ottico al posto di un SEM. Sebbene distruttivo, è utile per valutare la densità dei cristalli attraverso la griglia e per consentire il processo decisionale sull’opportunità di diluire o concentrare un campione per disperdere meglio i cristalli attraverso la griglia. Questo passaggio è molto utile quando sono disponibili un gran numero di cristalli e campioni particolarmente concentrati. L’aggregazione di cristalli dovrebbe essere evitata (Figura 3), poiché mentre non è un problema significativo se due cristalli sono illuminati contemporaneamente durante la raccolta dei dati6, ci sarà probabilmente un volume maggiore di liquido che circonda il grumo, riducendo così il segnale-rumore (Figura 5). Mentre è possibile osservare grandi eccessi di liquido a livello globale attraverso la griglia utilizzando un microscopio ottico, la valutazione del volume di liquido che circonda i microcristalli e la presenza di ghiaccio cristallino può essere effettuata solo utilizzando un microscopio elettronico dotato di un sistema di trasferimento del vuoto criogenico e di uno stadio. A volte, dopo l’applicazione dei cristalli alla griglia e prima che si verifichi il blotting, i cristalli in soluzioni a bassa viscosità possono depositarsi lungo un bordo della griglia. Abbiamo scoperto che sommare fino a una concentrazione finale del 50% di glicole etilenico può rallentare il movimento dei cristalli attraverso la goccia, garantendo una migliore distribuzione dei microcristalli attraverso la griglia e fornendo un maggiore controllo sul blotting aumentando il tempo di blotting (Figura 3D).

Alcune soluzioni di cristallizzazione contenenti agenti precipitanti viscosi come i PEG ad alto peso molecolare possono rivelarsi difficili da tamponare, richiedendo tempi di blotting sempre più lunghi (>10 s). In questi casi, può essere utile ridurre il volume di liquido depositato sul retro della griglia e il volume della soluzione contenente cristallo sul lato del film di supporto della griglia. Strategie come l’uso di 2 strati di carta assorbente o fibre di vetro possono anche aiutare a blotting in questi casi difficili31.

Mentre questa pipeline è adatta ai cristalli proteici solubili, quelli che si formano in mezzi molto viscosi come le proteine di membrana in LCP presentano una sfida diversa per la quale questo protocollo non è adatto. Tuttavia, stanno emergendo strategie per la preparazione di cristalli LCP su griglie crioTEM per microED che includono la riduzione della viscosità dei campioni inducendo un cambiamento di fase al LCP. Ciò consente di applicare i campioni alle griglie in modo simile a quello descritto in questo articolo. Infine, il campione può essere fresato con un fascio iogonico focalizzato per rimuovere il materiale non cristallino ineccesso 32,33,34.

Nel complesso, questa pipeline richiederà generalmente 1-2 ore (incluso il tempo di configurazione dell’apparecchiatura) per seguire dal campione che arriva a VMXm per fornire griglie ottimizzate con campioni ben dispersi e vetrificati, a seconda della disponibilità del campione, della concentrazione di cristalli e della viscosità della soluzione di cristallizzazione. Questi metodi sono già stati impiegati con successo per la preparazione di microcristalli per esperimenti di diffrazione a raggi X che esplorano il danno da radiazioni su microcristalli in cui un volume minimo di liquido che circonda il campione era essenziale28,35. Va notato che il protocollo può essere applicato a tutti i campioni di microcristalli solubili, non solo a campioni ben diffrattanti che sono già stati ottimizzati. Un esperimento di cristallizzazione che produce materiale microcristallino sarebbe tradizionalmente un obiettivo per l’ottimizzazione con l’obiettivo di ottenere cristalli più grandi, tuttavia, questo metodo di preparazione del campione e le capacità di VMXm possono consentire di raccogliere dati adeguati da tali campioni senza ulteriore ottimizzazione. In alternativa, se tali campioni microcristallini diffrattano male, i dati raccolti da VMXm utilizzando questo metodo di preparazione del campione potrebbero comunque fungere da guida utile per un’ulteriore ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione. Gli strumenti per la preparazione delle griglie, tra cui la scarica a bagliore e il congelamento a tuffo sono ora ampiamente disponibili negli istituti di ricerca attrezzati per esperimenti crioTEM e saranno disponibili per molti utenti consentendo loro di preparare campioni prima del beamtime a VMXm.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton e Dave Stuart, STRUBI University of Oxford e Rachel Bolton, Università di Southampton per aver gentilmente fornito campioni di microcristalli per lo sviluppo e la dimostrazione di metodi di preparazione del campione per la beamline VMXm oltre a consentire la messa in servizio della beamline. Gli autori desiderano inoltre ringraziare iNEXT-Discovery (numero di progetto 871037) per l’opportunità e il supporto nella pubblicazione di questo manoscritto.

Materials

Automated Cryo-EM plunge freezing instrument Leica or ThermoFisher Various
Benchtop light microscope with light source Various Various
Blade/Scalpel Fisher Scientific Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes Quantifoil N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes Agar Scientific AGG3727
ddH2O n/a n/a
Ethane gas supply n/a n/a
Ethylene Glycol Acros Organics 146750010
Glass microscope slides FisherBrand 12383118
Glass petri dish FisherBrand 455732
Glow discharging device Pelco 91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm) Bemis HS234526B
Large and small, fine forceps Agar Scientific Various
Liquid nitrogen supply n/a n/a
Pipette tips Various Various
Pipetting devices Various Various
Sealing tape for crystallisation plates. Molecular Dimensions MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars Spearlab Various
Sprung circlip clipping tool Subangstrom SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper Leica 16706440
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Referências

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).
  15. . MiTeGen Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020)
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

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Crawshaw, A. D., Beale, E. V., Warren, A. J., Stallwood, A., Duller, G., Trincao, J., Evans, G. A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline. J. Vis. Exp. (172), e62306, doi:10.3791/62306 (2021).
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