VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

1. 장비 설정 참고 : 여기에 설명 된 방법은 하나의 블로팅 팔과 플런지 동결 악기를 사용합니다. 일부 악기에는 두 개의 블로팅 암이 장착되어 있으며 제조업체의 지침에 따라 기기를 조정하여 단 한 개의 블로팅 팔만 사용할 것을 권장합니다. 가벼운 현미경이 플런지 동결 기기 근처에 위치하여 현미경과 플런지 냉동고가 모두 사용자의 손이 닿지 않도록 하십시오. 제조업체의 지침에 따라 자동 플런지 냉동고를 설정하고 식힙니다.참고: 샘플 챔버 온도는 결정이 커서 재배된 온도로 설정해야 합니다. 샘플 챔버에 얼룩진 용지를 놓지 마십시오.주의: 액체 에탄은 매우 인화성 폭발성이며 잠재적인 스파크 소스에서 멀리 떨어진 통풍이 잘 되는 지역에서만 사용해야 합니다. 그리드 박스에 적절히 라벨을 부착하고 액체 질소를 사용하여 작은 분해로 냉각하십시오. 조심스럽게 그리드, 탄소 필름 측면을 위로 배치, 빛 배출에 적합한 캐리어에 (예 : 파라 필름에 싸여 유리 현미경 슬라이드등). 15mA의 전류를 이용하여 0.39mBar에서 25s에 대한 글로우 방전 극저온 그리드. 그리드를 사용하기 직전에 글로우 방전. 빛이 배출된 격자를 페트리 접시에 넣을 때까지 보관하십시오. 광선 배출 후 30분 경과하면 광선 배출을 반복합니다.참고: 플런지 냉동고가 준비되고 그리드가 준비되면 주의가 샘플로 바뀔 수 있습니다. 2. 초기 블로팅 매개 변수 결정 샘플 챔버의 상대 습도를 90%로 설정하고 블로팅 시간을 5s로 설정하고 플런지 냉동고가 블로팅이 완료된 후 자동으로 시료를 급락하도록 설정되어 있는지 확인합니다.참고: 이러한 시작 매개 변수는 라이카 GP 플런지 냉동고에 가장 적합하며, 블로팅 힘과 같은 다른 매개 변수는 FEI Vitrobot에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험에서 크리스탈 무결성은 단일 블로팅 팔의 사용에 의해 유지 될 가능성이 높습니다. 잘 열리면 결정화 트레이를 밀봉할 수 있도록 작은 테이프 스트립을 자르고 한쪽 끝에 접어 밀봉의 개구부를 용이하게 하고 조심스럽게 한쪽에 배치할 수 있는 탭을 만듭니다. 저수지를 포함하여 결정화 위에 씰을 잘 열어 잘라냅니다. 신속하게 작동하면 낙하시 액체 부피를 유지하기 위해 드롭을 포함하는 결정에 2-5 μL의 저수지 용액을 적용하십시오. 테이프 탭을 사용하여 우물을 다시 밀봉하고 결정화 드롭이 건조되지 않도록 하십시오. 순간적으로 테이프를 결정화 위에 잘 열어 두는 동안, 저수지 용액의 10 μL을 0.5mL 튜브로 전송하여 나중에 단계로 사용하십시오. 우물을 다시 밀봉합니다. 플런지 동결 기구의 블로팅 암에 미리 잘라낸 블로팅 용지 한 조각을 놓습니다. 급락 에 단일 광선 배출 그리드를 배치 하여 집게를 동결하고 탄소 측이 블로팅 팔에서 멀리 직면하도록 기기에 적재합니다. 블로팅 챔버 내의 상대 습도가 90%인지 확인합니다. 스포프를 회전하여 탄소 필름 측이 블로팅 암을 향하도록 합니다. 2.5 μL 파이펫을 사용하여 0.5mL 튜브에서 냉동TEM 그리드의 비지지성(빛나는 구리) 측에 2μL의 저수지 용액을 적용합니다. 탄소 지지측이 블로팅 암에서 멀리 향하도록 그리드를 회전시키고 공정을 반복하여 그리드의 탄소 필름 지지측에 액체를 조심스럽게 가두십시오. 탄소 필름을 손상시키지 않도록 파이펫 팁으로 탄소 필름을 만지지 마십시오. 액체는 광선 배출 중에 증착된 충전으로 인해 그리드 전체에 퍼져야합니다. 그리드를 관찰하면서 블로팅 프로세스를 시작합니다. 보기 범위는 이를 위해 라이카 GP2에서 확인할 수 있습니다. 이 기간 동안 그리드의 탄소 표면에서 액체가 유입되는지 여부를 관찰하면, 이것은 액체가 그리드를 통해 사악할 때 그리드의 대부분의 액체 볼루스가 평평해지는 것으로 시작됩니다. 각 그리드 사각형의 액체가 더 감소함에 따라 그리드 표면을 가로질러 ‘터지는’ 파도를 관찰할 수 있습니다. 이 효과가 관찰되면 터지는 효과 결말의 2-3 s 이내에 블로팅을 중지할 수 있습니다. 버릴 수 있는 테스트 그리드를 급락할 필요는 없습니다. 소위 ‘터지는’ 효과가 관찰되지 않으면, 2.11-2.14단계를 반복하며, 매 번 블로팅 암이 그리드에서 후퇴하기 직전에 터지는 효과가 관찰될 때까지 블로팅 시간을 1-2로 연장한다. 3단계에 대해 이 시간을 유의하십시오.참고: 이 터지는 효과가 생기자마자 블로팅이 멈추는 것이 중요하며, 공정 중에 크리스탈이 과도하게 블로팅으로 인해 탈수되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 결정이 일관된 용액의 적용을 받을 수 있도록 하여 결정화 위험을 줄이므로 샘플의 백 블로팅 및 희석을 위해 저장소에서 결정화 용액을 사용합니다. 3. 크리스탈 수확 결정화 플레이트를 광 현미경 아래에 놓고 대상을 시야 내에 잘 배치합니다. 플런지 냉동고 집게에 신선한 광채 배출 그리드를 놓고 플런지 냉동고에 집게를 장착하고, 탄소 필름 면은 블로팅 암에서 멀리 향합니다. 스포프를 회전하여 탄소 필름 측이 블로팅 암을 향하도록 합니다. 2.5 μL 파이펫을 사용하여 0.5mL 튜브에서 극저온TEM 그리드의 비지지측에 2μL의 저수지 용액을 적용하고 그리드를 회전하여 탄소필름 지지측이 플런지 냉동고의 샘플 포트를 향하고 있다. 임시 씰을 다시 껍질을 벗기고 파이펫을 2 μL로 설정하고 결정화 방울을 반복적으로 흡계하여 미세 결정을 중단합니다(방울에 기포를 도입하지 않는 것이 중요합니다).참고: 어떤 표면 피부 또는 우물의 기지에서 결정이 방출되는지 확인하기 위하여 빛 현미경의 밑에 이 과정을 관찰하는 것이 중요합니다. 결정이 붙어 있고 포부로 작성되지 않으면 파이펫 팁 또는 침술 바늘과 같은 다른 결정화 도구를 사용하여 결정을 부드럽게 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 결정의 크기와 광 현미경의 필드 깊이에 따라, 때로는 현미경, 피펫 팁을 입력 하는 결정을 사용 하 여 볼 수 있다. 흡량제 미세 결정 슬러리의 2 μL을 플런지 냉동고에 옮기고 모든 샘플을 극저온TEM 그리드의 탄소 측에 적용합니다. 2단계에서 결정된 시간 동안 블롯은 즉시 플런지 동결을 시작합니다. 블로팅하는 동안 그리드 전체에서 터지는 파 효과의 발생을 관찰하고 이것이 그리드 를 가로 질러 완전히 발생했는지 여부를 기록하십시오. 결정의 존재는 초기 블로팅 시간에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 1-2 초까지 후속 그리드에 대해 조정해야 할 수도 있습니다. 신속하게 작동하여 액체 에탄에서 액체 질소에 침지된 그리드 박스로 그리드를 전송합니다. 잔류 에탄은 액체 질소에 들어갈 때 그리드에 불투명한 흰색 고체로 전환 할 수 있습니다. 이를 줄이려면 액체 에탄에서 그리드를 꾸준히 제거한 다음 액체 질소 저장소로 신속하게 전달합니다. 그리드 박스에 4개의 그리드가 배치되면 나사로 상자 뚜껑을 고정하고 액체 질소의 거품 분해로 전송하여 스캐닝 전자 현미경(SEM)을 이용한 추가 샘플 평가를 허용하거나 적절한 저장 용기를 사용하여 액체 질소 저장 분해로 전송합니다. 4. 빛 현미경 검사법에 의한 샘플 밀도 평가 주의: 이 방법은 파괴적입니다. 하나 또는 두 개의 결정화 물방울과 같은 시료의 가용성이 제한된 경우 이 단계를 건너 뛰는 것이 좋습니다. 급락 동결 시료(step 3.7) 후 그리드를 가로지르는 결정분포를 평가할 수 있다. 플런지-냉동고 집게에 건조하고 실온 극저온 그리드를 장착하고, 시야에 그리드를 장착하여 가벼운 현미경에 집게를 배치합니다. 전체 그리드와 개별 그리드 사각형을 해결할 수 있도록 적절한 배율및 포커스를 설정합니다. 3.1-3.7 단계를 따르십시오. 그리드 박스(3.8단계)로 그리드를 전송하는 대신 플런지-냉동고를 재설정하여 액체 에탄에서 급락한 그리드를 철회합니다.주의: 그리드와 샘플은 실온으로 따뜻해지며 추가 회절 실험에는 사용할 수 없습니다. 플런지 동결 기기에서 집게를 제거합니다. 집게 내에서 그리드를 유지하는 동안, 빛 현미경 아래에 그리드를 배치 – 초점은 이미 대략 설정됩니다. 미세 한 초점을 수행하고 그리드에 걸쳐 결정의 밀도를 평가합니다. 좋은 그리드는 각 그리드 정사각형 내의 그리드 바에서 떨어져 몇 가지 격리 된 결정을 포함하고 결정의 응집은 최소화됩니다. 그리드 내의 결정 밀도가 몇 개의 격리된 결정만으로 결정의 뭉치를 초래하는 경우, 수정 슬러리를 저수지 용액으로 희석시키고 3단계를 반복합니다. 희석이 결정의 용해를 초래하지 않도록 샘플을 희석 할 때주의하십시오. 0.5-1 μL의 소량을 사용하여 단계에서 결정을 희석시. 5. 전자 현미경 검사에 의한 샘플 평가 참고: 극저온 그리드에 대한 미세 결정 제제는 극저온 조건 하에서 스캐닝 전자 현미경 검사법(SEM)으로 가장 잘 평가되며, 극저온 스테이지가 장착된 SEM으로 달성할 수 있습니다. VMXm에서는 쿼럼 PP3006 에어록과 저온스테이지가 있는 JEOL JSM-IT100 SEM(텅스텐 소스)이 활용됩니다. VMXm28,29에서샘플을 볼 때 최소한의 방사선 손상을 보장하기 위해 다음 설정이 사용됩니다: 5 kV 가속 전압; 40의 스팟 크기 (JEOL JSM-IT100에 임의 단위); 10mm 작동 거리. 이미지는 이차 전자 검출기를 사용하여 기록되며, 샘플 정렬및 0.8 μs의 거주 시간을 집중하는 데 사용되며 단결정의 고해상도 이미지는 16 μs의 거주 시간을 사용하여 캡처됩니다. 현미경이 제조업체 지침에 따라 정렬되는 SEM에 샘플을 로드하기 전에 중요합니다. 동일한 매개 변수로 준비된 나머지 그리드는 X 선 회절 실험을 위해 예약되어 있는 동안 단일 그리드만 SEM에 로드됩니다. 제조업체의 지시에 따라 시료 극저온 스테이지를 -180°C로 냉각하여 SEM을 준비한다. cryoTEM 그리드를 사용 가능한 특정 시스템에 로드하는 지침을 따르십시오. SEM에 적재된 시료를 사용하여 전자 빔을 켜고 시료를 정렬하고 높은 배율(0.8 μs 거주 시간)을 사용하여 초점을 설정합니다. 먼저, 낮은 배율(x45)에서 보기에서 그리드 전체와 함께 초기 평가를 수행합니다. 이 배율에 이미지를 기록합니다. 개별 그리드 제곱을 면밀히 검사할 수 있도록 배율을 높이고 개별 결정은 매우 명확하게 관찰할 수 있어야 합니다. 그리드 주위를 이동하여 진행 하기 전에 다음 요구 사항을 충족하는 지 확인 의 스틸 이미지 (16 μs 거주 시간)를 캡처합니다. 그리드가 평평하고 탄소 지원 필름이 대체로 손상되지 않도록 합니다. 크리스탈을 둘러싼 유리화 액체의 좁은 후광이 있는 수많은 단일 결정이 있는지 확인하십시오. 탄소 지지 필름의 구멍이 표시되는지 확인합니다. 어둡고 매끄러운 외관에 의해 정의된 유리화 된 액체의 큰 영역이 없는지 확인하십시오. 육각형 얼음이 거의 없거나 전혀 없는지 또는 그리드 에 걸쳐 표면 얼음이 흩어져 있는지 확인합니다. 결정이 지지필름에 고르게 분포되어 있고 겹치지 않도록 합니다. 이 시점에서 여러 결정의 치수를 정확하게 측정하여 나중에 회절 실험 중에 정확한 X선 빔 크기 상관 관계를 허용합니다. SEM에서 안정적으로 검색되고 극저온 온도에서 유지관리할 수 있는 샘플은 나중에 X선 회절 실험에 사용할 수 있습니다. 이것이 불가능한 경우 이러한 샘플을 폐기하십시오.참고: 전체 그리드와 개별 마이크로결정(각각 약 x45 및 x700 배율)을 이미징하는 동안 동일한 매개 변수를 사용하여 준비된 그리드로 빔라인으로 진행할지 또는 3단계에서 일부 파라미터가 조정해야 하는지 여부에 대한 평가가 이루어져야 합니다. 그리드는 5.5 단계에서 설명된 테스트를 충족해야 합니다. 그리드가 이러한 기준을 충족하지 못하면 5단계를 반복하기 전에 3단계에서 추가 최적화가 필요합니다. 6. VMXm에서 회절 실험을 위한 그리드 준비 액체 질소를 사용하여 대형 발포 제와르(도 4B)에서 샘플 로더(도4B)로샘플 카트리지(뚜껑 포함)에 적재된 VMXm 샘플 홀더(도4A)(최대5개)의 필수 수를 냉각-이는 액체 질소의 대량을 요구할 수 있다. 액체 질소 수준은 샘플 로더의 샘플 위치 바로 위에 있어야 합니다. circlips 및 도구를 준비합니다. 클리핑 도구, 집게 및 VMXm 샘플 집게를 포함한 도구를 샘플 로더의 구멍에 배치하여 식힙니다. 그것은 dewar 위에 스포트라이트를 배치하는 것이 유용 할 수 있습니다. 마이크로크리스탈로드 그리드가 포함된 그리드 박스를 샘플 로더의 그리드 박스 오목으로 신속하게 전송하고 뚜껑을 풀어 느슨하고 회전할 수 있도록 (제거하지 않음). 액체 질소하에서 큰 집게로 샘플 카트리지에서 뚜껑을 제거하고 샘플 로더 아래에 놓습니다. VMXm 샘플 집게를 사용하여 샘플 홀더를 샘플 로더에 들어 올려 홀더가 위쪽으로 향하여 그리드를 수락할 수 있도록 합니다. 올바른 위치에 있는 경우 샘플 로더의 작은 핀이 샘플 홀더 중간에 있는 작은 구멍과 결합합니다. 냉각된 미세 집게를 사용하여 그리드 박스에서 그리드를 조심스럽게 들어 올리고 샘플 홀더의 그리드 개구부에 가깝게 전송합니다. 그리드를 회전하여 평평하게 배치되도록 합니다(지원 필름 측이 어떤 방식으로 향하고 있는지는 중요하지 않습니다). 그리드가 그리드 개구부 위로 가능한 한 가까이 되도록 집게를 부드럽게 낮추고 그리드를 개구부로 놓습니다. 그리드가 제대로 앉지 않으면 미세 한 집게를 사용하여 그리드를 제자리에 고정하거나 더 큰 집게로 샘플 홀더를 부드럽게 누릅니다. 미리 냉각된 순환 도구를 그리드 개구부그리드 위에 신속하게 배치하고 버튼을 눌러 서클립을 앉힙니다. circlip이 제대로 앉아 있는지 확인하기 위해 버튼의 우울증 2개를 적용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 액체 질소를 위로 올려 레벨이 샘플 홀더 위에 ~ 1.5 cm 가되도록합니다. VMXm 샘플 집게를 사용하여 로드된 샘플 홀더를 샘플 로더의 작은 핀 위로 들어 올려 샘플 카트리지로 다시 들어올립니다. 샘플 카트리지의 샘플 홀더의 위치 번호를 기록합니다. 모든 샘플이 로드될 때까지 샘플 홀더에 그리드를 계속 로드합니다. 샘플이 내부에 남아 있는 경우 그리드 박스를 저장소 분해로 반환하고 데워에서 샘플 로더를 제거하여 더 많은 공간을 만듭니다. 카트리지의 카트리지 뚜껑을 교체하여 카트리지 상단의 핀이 뚜껑의 구멍과 결합되도록 합니다. 시원하고 액체 질소로 VMXm 에어록 드워드를 채우고 로드 된 샘플 카트리지를 포함하는 거품 분해 옆에 놓습니다. VMXm 카트리지 도구를 사용하여 카트리지 측면의 능선에 공구를 조심스럽게 참여시키고 카트리지를 에어록 데워로 신속하게 들어올립니다. 액체 질소 수준이 카트리지를 덮는지 확인합니다. 에어록 디워드에 뚜껑을 놓고 로드된 샘플 카트리지가 있는 VMXm 엔드스테이션으로 진행합니다.참고: 샘플 카트리지를 VMXm 엔드스테이션에 로드하면 빔라인 직원이 수행됩니다.