JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

Published: June 17, 2021
doi:
10.3791/62306
, , , , , ,
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council,Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute,Harwell Science and Innovation Campus

Summary

Отношение сигнал/шум данных является одним из наиболее важных соображений при выполнении измерений дифракции рентгеновских лучей из микрокристаллов. Лучевая линия VMXm обеспечивает среду с низким уровнем шума и микролуч для таких экспериментов. Здесь описаны методы пробоподготовки для монтажа и охлаждения микрокристаллов для VMXm и других микрофокусных макромолекулярных кристаллографических лучевых линий.

Abstract

Монтаж микрокристаллов (<10 мкм) для монокристаллической криокристаллографии представляет собой нетривиальную задачу. Улучшения качества данных были замечены для микрокристаллов с развитием лучевой оптики, стабильности луча и фокусировки переменного размера луча от субмикрона до микронов, например, на линии луча VMXm в Diamond Light Source1. Дальнейшее повышение качества данных будет получено за счет улучшения выборочной среды и подготовки образцов. Микрокристалла по своей природе генерируют более слабую дифракцию, поэтому улучшение сигнал-шум является ключом к сбору качественных данных о рентгеновской дифракции и будет преимущественно происходить за счет снижения фонового шума. Основными источниками рентгеновского фонового шума в дифракционном эксперименте являются их взаимодействие с воздушным трактом до и после образца, избыток кристаллизационного раствора, окружающий образец, наличие кристаллического льда и рассеяние от любых других лучевых приборов или рентгеновских окон. Лучевая линия VMXm включает в себя контрольно-измерительные приборы и протокол пробоподготовки для уменьшения всех этих источников шума.

Во-первых, вакуумная среда для отбора проб в VMXm удаляет воздушный путь между источником рентгеновского излучения и образцом. Далее, протоколы пробоподготовки для макромолекулярной кристаллографии в VMXm используют ряд процессов и инструментов, адаптированных из cryoTEM. К ним относятся медные решетки с дырянистыми углеродными опорными пленками, автоматизированная робототехника для промокления и погружного охлаждения с использованием жидкого этана. Эти инструменты позволяют получать сотни микрокристаллов на одной криотемной сетке с минимальным количеством окружающей жидкости на малошумной опоре. Они также минимизируют образование кристаллического льда из любой оставшейся жидкости, окружающей кристаллы.
Представлен процесс подготовки и оценки качества растворимых белковых микрокристаллов с использованием видимого света и сканирующей электронной микроскопии перед установкой образцов на лучевую линию VMXm для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей. Мы также предоставим примеры образцов хорошего качества, а также те, которые требуют дальнейшей оптимизации и стратегий для этого.

Introduction

Основным барьером для определения структур биологических молекул с высоким разрешением методом высокомолекулярной кристаллографии (MX) остается получение кристаллов, дифракционизируемых скважин в податливом размере. Существует множество стратегий для достижения этой цели от проектирования конструкции гена рекомбинантного белка до поиска химических коктейлей в большой разреженной матрице, которые могут генерировать начальные кристаллы2. Для последнего часто бывает так, что кристаллографу необходимо оптимизировать любые начальные попадания для получения кристаллов с достаточным дифракционным качеством и размером для исследований определенияструктуры 3. Несмотря на эти варианты, некоторые молекулы-мишени могут никогда не генерировать большие (>10 мкм), хорошо дифрагирующие кристаллы, и в результате кристаллограф должен упорствовать с их микрокристаллами и проблемами, которые представляют такие образцы. К ним относятся надлежащая установка и криозащита кристаллов, управление по своей сути более слабой дифрацией и повышенной радиационной чувствительностью. Микрокристалы образуются из меньшего количества единичных клеток и молекул, чем более крупные кристаллы, и поэтому дифракция не усиливается в той же степени по сравнению с более крупными кристаллами, что приводит к более слабым интенсивностям дифракции. Важно, чтобы фоновый сигнал не маскировывал эти отражения, особенно при более высоком разрешении, где слабая интенсивность отражения может быть потеряна4. Кроме того, микрокристалла более чувствительны к радиационному повреждению и, несмотря на регистрацию дифракции при температуре жидкого азота5,может оказаться невозможным собрать полные данные из монокристалла, что делает необходимым сбор данных из очень большого количества кристаллов для получения единого полного набора данных6.

Растущая доступность рентгеновских лазеров на свободных электронах (XFELs) и эволюция методов серийной кристаллографии (SFX)7 обеспечили пути сбора данных из небольших микрокристаллов. Тем не менее, это индивидуальные методы доставки образцов, которые требуют значительного количества аппаратных и программных знаний, где эксперименты ограничены комнатной температурой и, как правило, потребление образца велико (сотни микролитров) и все еще может потребовать дальнейшей оптимизации8. Таким образом, проекты, в которых может быть изготовлено только ограниченное количество микрокристаллов, не подходят для SFX.

Между тем, технология синхротронных лучевых линий за последние десятилетия прогрессировала в создании меньших, более стабильных пучков9 с блеском, который позволил сбор данных из все меньших кристаллов10,11. Микрофокусные линии пучка, такие как FMX в NSLS-II и I24 в Diamond Light Source, смогли определить новые структуры из кристаллов с максимальными размерами ~ 3 мкм12 и продемонстрировать способность собирать полезные данные из еще меньших кристаллов размером ~ 1 мкм13. Линия луча должна быть точно сконфигурирована, с отличной оптикой с высоким разрешением по оси, минимальной сферой путаницы для вращения образца и точно выровненной осью вращения, которая совпадает с рентгеновским лучом. Важно точно сопоставить профиль рентгеновского пучка с объемом кристалла и убедиться, что кристалл точно выровнен в рентгеновском пучке – проблема для кристаллов <5 мкм14. Выполнение этих экспериментальных условий на линии луча имеет важное значение для записи данных наилучшего качества из микрокристаллов.

Оставшимся и, возможно, наиболее важным аспектом сбора данных из микрокристаллов является представление кристалла рентгеновскому пучку. Микрокристаллы часто монтировались на микросетчатых образцовых креплениях, изготовленных из полиимида, материала с низким рентгеновским рассеянием с отверстиями размером до 10 мкм15,16. Полиимидная сетка установлена на стандартном штифте, который устанавливается в магнитное основание SPINE, что делает ее совместимой с большинством лучевых линий MX17. Сетчатое крепление используется для ловли кристаллов из кристаллизации, часто следуя той же процедуре, что и монтаж кристалла 100 мкм с использованием стандартного петлевого крепления. В то время как кристаллы могут быть распределены по сетке, ключевым недостатком является то, что относительно большой объем жидкости может переноситься сеткой и штифтом во время сбора урожая(рисунок 1C,D). Этот объем жидкости, который может быть во много раз больше, чем сами кристаллы, будет способствовать фоновому шуму при освещении рентгеновскими лучами. Этот фоновый рассеяние может быть еще сильнее, если жидкость образует кристаллический лед во время внезапного охлаждения, уменьшая отношение сигнал/шум и без того слабых интенсивностей в пределах разрешений дифракции льда. Поэтому важно, чтобы избыток жидкости удалялся из образца, чтобы гарантировать, что все возможные сигналы могут быть записаны. Эта проблема еще больше в случае кристаллов мембранного белка, образующихся в липидной кубической фазе (LCP), где LCP генерирует сильное фоновое рассеяние и также трудно удалить из кристаллов 18.

Новая универсальная микрофокусная линия микрофокуса макромолекулярной кристаллографии (VMXm) в Diamond Light Source обеспечивает условия для сбора данных из кристаллов размером менее микрона. Линия луча была разработана для доставки профиля пучка размером 0,3 мкм x 0,5 мкм (VxH)1,гониометра со сферой путаницы не более 60 нм и среды образца в вакууме. Эти конструктивные особенности конечной станции VMXm минимизируют генерацию фонового рентгеновского шума аппаратом beamline во время сбора данных с наибольшим оставшимся источником фона, генерируемого образцом14.

Специальные методы пробоподготовки, разработанные для линии луча VMXm, дают возможность уменьшить этот фон и еще больше улучшить сигнал-шум дифракционных данных, максимизируя качество данных, которые могут быть записаны из микрокристаллов, измеряющих <10 мкм. Многие из требований, изложенных здесь для низкофоновой дифракции от микрокристаллов, также являются общими для криогенной просвечивающих электронных микроскопий (криотЭМ)19 и микрокристаллической электронной дифракции (микроED)20. В результате многие из инструментов, которые уже были разработаны для подготовки образцов криотЭМ, подходят, с некоторыми адаптациями, для приготовления микрокристаллов. При подготовке образцов для криотем для одиночных частиц исследуемые частицы встроены в очень тонкие слои (обычно <100 нм) стекловидного льда, так что электроны способны передаваться через образец. Тонкий однородный слой достигается путем смывания лишней жидкости, а витрификация образца достигается быстрым охлаждением образца (~104Кс-1)21путем погружения в жидкий этан, удерживаемый при ~93 К22. Напротив, жидкий азот, обычно используемый для пробоподготовки MX, является менее эффективным криогеном, чем этан, и имеет большую склонность к образованию кристаллического льда в образце21. Образование кристаллического льда, который может разлагать дифракцию и генерировать фоновый шум, обычно смягчается за счет использования криопротекторных соединений23. Низкомолекулярные полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) 400 и метил-2,4-пентанедиол (MPD), сахара, масла или насыщенные соли, могут быть добавлены к аликвоте кристаллизационного раствора в низких концентрациях24– не существует универсального решения для выбора наиболее подходящего криопротектора, и это часто требует оптимизации25 . Кристалл также подвергается множественным манипуляциям во время сбора и криозащитного процесса, что может привести к повреждению кристалла, возможность использования жидкого этана позволяет пропускать этот этап и помогает защитить целостность кристалла.

В то время как жидкий этан является эффективным криогеном для микрокристаллов (<10 мкм) из-за тонкости образца, существуют альтернативные методы предотвращения образования кристаллического льда, особенно в более крупных кристаллах, включая снижение содержания воды в кристалле путем использования жестко контролируемой влажной среды26или путем впитывания избыточной жидкости как от петли, так и от поверхности кристалла27. , однако они снова требуют больших манипуляций с образцом. Использование автоматизированного промокания и погружной заморозки жидким этаном, как в криотэме, вместе удаляет избыточный кристаллизационный раствор и обеспечивает средство для контролируемой вспышки холодных микрокристаллов, пытаясь свести к минимуму манипуляции.

Здесь мы представляем протокол, который может быть использован не только пользователями лучевой линии VMXm и другими микрофокусными линиями пучка для сбора данных о дифракции высокого сигнал-шум, но также может быть полезен для тех, кто готовит образцы кристаллов мембранного белка на основе мембранных белков и детергентов для экспериментов с микроЭД. В то время как все средства для подготовки и оценки образцов доступны в VMXm, многие лаборатории структурной биологии все больше оснащаются для подготовки образцов cryoTEM. В результате мы предполагаем, что некоторые пользователи, возможно, пожелают использовать свои собственные средства для подготовки своих образцов к времени луча на VMXm.

Protocol

1. Настройка оборудования ПРИМЕЧАНИЕ: Методы, описанные здесь, используют инструмент для погружения с одним блоттинг-рычагом. Некоторые инструменты оснащены двумя блоттинг-маниками, и мы советуем пользователю проверить инструкции производителей по регулировке инструмента, чтобы использовался только один блоттинговый рычаг. Убедитесь, что световой микроскоп расположен рядом с инструментом погружной заморозки, в идеале так, чтобы и микроскоп, и морозильная камера находились в легкой досягаемости пользователя. Установите и охладите автоматизированную морозильную камеру в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Температура камеры образца должна быть установлена на температуру, при которой кристаллы были выращены. Не помещайте промокательную бумагу в камеру для образцов.ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Жидкий этан является легковоспламеняющимся взрывчатым веществом и должен использоваться только в хорошо проветриваемом помещении вдали от потенциальных источников искры. Соответствующим образом маркируют коробки сетки и охлаждают их в небольшом дьюаре с использованием жидкого азота. Аккуратно поместите сетки, углеродную пленку стороной вверх, на соответствующий носитель для разрядки свечения (например, стеклянный микроскоп, обернутый в парапленку). Сетки криотека нагнетательного разряда на 25 с при 0,39 мБар, используя ток 15 мА. Тлеющий разряд непосредственно перед использованием сетки. Держите тлеющий разряд сетки в покрытой чашке Петри до готовности; если после накаливания истекает 30 мин, повторите разряд свечения.ПРИМЕЧАНИЕ: Когда морозильная камера готова и сетки подготовлены, внимание может обратиться к образцу. 2. Определение начальных параметров блоттинга Установите относительную влажность камеры для отбора проб на 90%, а время промоктирования на 5 с и убедитесь, что погружная морозильная камера настроена на автоматическое погружение образца после завершения блоттинга.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти стартовые параметры наиболее подходят для погружной морозильной камеры Leica GP, другие параметры, такие как сила пятения, доступны на FEI Vitrobot. Однако, по нашему опыту, целостность кристаллов с большей вероятностью будет поддерживаться с помощью одного блоттингового рычага. Чтобы иметь возможность запечатать кристаллизационный лоток после открытия интересующей скважины, отрежьте небольшую полоску ленты и сложите на одном конце, чтобы создать выступ, облегчающий открытие уплотнения и аккуратно расположив его с одной стороны. Разрежьте уплотнение над кристаллизацией скважины, включая резервуар. Работая быстро, нанесите 2-5 мкл резервуарного раствора на кристалл, содержащий каплю, чтобы сохранить объем жидкости в капле. Используйте вкладку ленты, чтобы затем повторно запаять скважину и убедиться, что капля кристаллизации не высохнет. При кратковреминутном удержании ленты над кристаллизационной скважиной переложите 10 мкл пластового раствора в трубку объемом 0,5 мл для использования на последующих этапах. Засовить колодец. Поместите кусок предварительно вырезанной промокательной бумаги на промокающий рычаг инструмента для замораживания погружения. Поместите одну сетку с тлеющим разрядом в погружные морозильные щипцы и нагрузите в инструмент так, чтобы углеродная сторона была обращена в сторону от пятнистого рычага. Убедитесь, что относительная влажность в камере для блоттинга составляет 90%. Поверните щипцы так, чтобы сторона углеродной пленки была обращена к пятнистой руке. Используя пипетку объемом 2,5 мкл, нанесите 2 мкл резервуарного раствора из трубки объемом 0,5 мл на необеспечивающую (блестящую медную) сторону сетки cryoTEM. Поверните сетку так, чтобы сторона углеродной опоры была обращена в сторону от пятнистого рычага, и повторите процесс, осторожно применяя жидкость к углеродной пленке опорной стороны сетки. Избегайте прикосновения к углеродной пленке с наконечником пипетки, чтобы не повредить углеродную пленку. Жидкость должна распространяться по всей сетке из-за заряда, осажденного во время разрядки свечения. Инициируйте процесс промоктирования во время наблюдения за сеткой. Для этого на Leica GP2 имеется зрительный прицел. Посмотрите, извлекается ли жидкость из углеродной поверхности сетки в течение этого времени, это начинается с того, что большая часть жидкого болюса на сетке сплющивается, когда жидкость проходит через сетку. По мере того, как жидкость в каждом квадрате сетки уменьшается еще больше, можно наблюдать волну «лопнувших» по поверхности сетки. Если этот эффект наблюдается, блоттинг можно остановить в течение 2-3 с после окончания эффекта выскакивания. Нет необходимости погружать тестовую сетку, которую можно отбросить. Если так называемый эффект «лопающихся» не наблюдается, повторите шаги 2.11-2.14, каждый раз увеличивая время пятнистого на 1-2 с, пока эффект лопа не будет наблюдаться непосредственно перед тем, как пятнистая рука втягивается из сетки. Обратите внимание на это время для шага 3.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы промокание прекращалося, как только этот эффект лопанья произошел, чтобы гарантировать, что во время процесса кристаллы не обезвоживаются от чрезмерного промоктирования. Используйте кристаллизационный раствор из резервуара для обратного промокления и разбавления образца, так как он гарантирует, что кристаллы подвергаются последовательному раствору, снижая риск дестабилизации кристаллов. 3. Сбор кристаллов Поместите кристаллизуальную пластину под световой микроскоп и поместите цель в поле зрения. Поместите свежую, разряженную на тлеющим накаливание сетку в щипцы погружной морозильной камеры и установите щипцы в погружной морозильной камере, причем сторона углеродной пленки обращена в сторону от пятнистого рычага. Поверните щипцы так, чтобы сторона углеродной пленки была обращена к пятнистой руке. Используя пипетку объемом 2,5 мкл, нанесите 2 мкл резервуарного раствора из трубки объемом 0,5 мл на неподдерживающую сторону сетки cryoTEM и поверните сетку так, чтобы опорная сторона углеродной пленки была обращена к отверстию для отбора проб погружной морозильной камеры. Отклейте временное уплотнение и установите пипетку на 2 мкл осторожно аспирируйте каплю кристаллизации несколько раз, чтобы приостановить микрокристаллы (важно не вводить пузырьки воздуха в каплю).ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно наблюдать этот процесс под световым микроскопом, чтобы убедиться, что кристаллы высвобождаются из любой поверхностной кожи или основания скважины. Если кристаллы застряли и не вытянуты с аспирацией, для мягкого смещения кристаллов можно использовать наконечник пипетки или другие инструменты кристаллизации, такие как игла для акупунктуры. В зависимости от размера кристаллов и глубины резкости светового микроскопа иногда можно увидеть с помощью микроскопа кристаллы, поступающие в наконечник пипетки. Переложите 2 мкл аспирированной микрокристаллической суспензии в погружную морозильную камеру и нанесите весь образец на углеродную сторону сетки cryoTEM. Промокните на время, определенное на шаге 2 и немедленно инициируйте погружение-замораживание. Во время промокания понаблюдайте за возникновением эффекта лопнующей волны по всей сетке и обратите внимание, произошло ли это полностью по всей сетке. Наличие кристаллов может повлиять на начальное время промокления, и это, возможно, потребуется скорректировать для последующих сеток на 1-2 с. Работая быстро, перенесите сетку из жидкого этана в сетку, погруженную в жидкий азот. Остаточный этан может превратиться в непрозрачное белое твердое вещество на сетке, когда он попадает в жидкий азот. Чтобы уменьшить это, удалите сетку неуклонно из жидкого этана, затем быстро переложите в резервуар жидкого азота. После того, как 4 сетки были помещены в ящик для сетки, закрепите крышку коробки винтом и перенесите ее либо в пену из жидкого азота, чтобы обеспечить дальнейшую оценку образцов с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), либо в хранилище жидкого азота с использованием соответствующего контейнера для хранения. 4. Оценка плотности образца с помощью световой микроскопии ВНИМАНИЕ: Этот метод является разрушительным. Если доступность образца ограничена, например, только одна или две капли кристаллизации, рекомендуется пропустить этот этап. После погружения замороженных образцов (этап 3.7) можно оценить распределение кристаллов по сетке. Установите сухую сетку cryoTEM комнатной температуры в щипцах с морозильной камерой и поместите щипцы на бок на световой микроскоп, с сеткой в поле зрения. Установите соответствующее увеличение и фокусировку, чтобы можно было разрешить всю сетку и отдельные квадраты сетки. Выполните шаги 3.1-3.7. Вместо того, чтобы переносить сетку в сетку (шаг 3.8), втяните погруженную сетку из жидкого этана, сбросив морозильную камеру.ВНИМАНИЕ: Сетка и образец нагреваются до комнатной температуры и не могут быть использованы для дальнейших дифракционных экспериментов. Снимите щипцы с инструмента погружения. Удерживая сетку внутри щипцов, поместите сетку под световой микроскоп — фокус уже будет примерно установлен. Выполните тонкую фокусировку и оцените плотность кристаллов по всей сетке. Хорошая сетка будет содержать несколько изолированных кристаллов вдали от стержней сетки в каждом квадрате сетки, и скопление кристаллов минимально. Если плотность кристаллов внутри сетки приводит к слипание кристаллов только с несколькими изолированными кристаллами, дополнительно разбавляют кристаллическую суспензию резервуарным раствором и повторяют этап 3. Позаботьтесь о том, чтобы разбавление образцов не приводило к растворению кристаллов. Разбавляют кристаллы поэтапно, используя небольшие объемы 0,5-1 мкл. 5. Оценка образца с помощью сканирующей электронной микроскопии ПРИМЕЧАНИЕ: Микрокристаллическую подготовку на сетках cryoTEM лучше всего оценивать с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) в криогенных условиях, это может быть достигнуто с помощью SEM, оснащенного крио-ступенью. На VMXm используется JEOL JSM-IT100 SEM (вольфрамовый источник) с воздушным шлюзом Quorum PP3006 и криосценой. Для обеспечения минимального радиационного поражения при просмотре образцов на VMXm28,29используются следующие настройки: ускоряющее напряжение 5 кВ; размер пятна 40 (произвольные единицы на JEOL JSM-IT100); Рабочее расстояние 10 мм. Изображения записываются с помощью вторичного электронного детектора, для выравнивания образца и фокусировки используется время выдержки 0,8 мкс, в то время как изображения монокристаллов с высоким разрешением захватываются с использованием времени выдержки 16 мкс. Перед загрузкой образца в SEM важно, чтобы микроскоп был выровнен в соответствии с инструкциями производителя. Рекомендуется, чтобы в SEM загружалась только одна сетка, в то время как любые оставшиеся сетки, подготовленные с теми же параметрами, резервировались для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей. Подготовьте SEM путем охлаждения криоступенчаты образца до -180 °C в соответствии с инструкцией производителя. Следуйте инструкциям по загрузке сеток cryoTEM в конкретную доступную систему. Когда образец загружен в SEM, включите электронный пучок, выровняйте образец и установите фокус, используя высокое увеличение (время выдержки 0,8 мкс). Во-первых, выполните первоначальную оценку со всей сеткой при небольшом увеличении (x45). Запишите изображение при таком увеличении. Увеличьте увеличение, чтобы можно было более внимательно рассмотреть отдельные квадраты сетки, отдельные кристаллы должны быть очень четко наблюдаемыми. Перемещайтесь по сетке, захватывая неподвижные изображения (время выдержки 16 мкс) кристаллов, гарантируя, что они соответствуют следующим требованиям, прежде чем продолжить: Убедитесь, что решетки плоские, а углеродная опорная пленка в значительной степени неповреждена. Убедитесь, что вокруг кристалла есть многочисленные монокристаллы с узким ореолом остеклованной жидкости. Убедитесь, что отверстия в углеродной опорной пленке видны. Убедитесь, что нет больших областей остеклованной жидкости, как это определено темным и гладким внешним видом. Убедитесь, что по всей сетке мало или вообще нет шестиугольного льда или поверхностного льда. Убедитесь, что кристаллы равномерно распределены по опорной пленке и не перекрываются. На этом этапе точно измерьте размеры ряда кристаллов, чтобы обеспечить точную корреляцию размеров рентгеновского пучка во время более поздних дифракционных экспериментов. Образцы, которые могут быть надежно извлечены из SEM и поддерживаться при криогенных температурах, могут быть позже использованы для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей. Если это невозможно, утилизируйте эти образцы.ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации как всей сетки, так и отдельных микрокристаллов (приблизительно увеличение x45 и x700 соответственно) следует провести оценку того, следует ли переходить к линии луча с сетками, подготовленными с использованием тех же параметров, или некоторые параметры могут нуждаться в корректировке на этапе 3. Сетки должны соответствовать испытаниям, описанным в шаге 5.5. Если сетки не соответствуют этим критериям, перед повторением шага 5 требуется дальнейшая оптимизация на шаге 3. 6. Подготовка сетки к дифракционным экспериментам на VMXm Охладить необходимое количество держателей образцов VMXm(рисунок 4А)(до 5), загруженных в картридж образца (с крышкой) с помощью загрузчика образцов в большом пенопластовом дьюаре(рисунок 4В)с использованием жидкого азота – для этого может потребоваться большой объем жидкого азота. Уровень жидкого азота должен быть чуть выше положения образца на загрузчике проб. Подготовьте циркуляры и инструменты. Поместите инструменты, включая клипсатор, щипцы и щипцы для образцов VMXm, в отверстия в загрузчике образцов для охлаждения. Может быть полезно расположить прожектор над дьюаном. Быстро перенесите коробку сетки, содержащую нагруженные микрокристаллом сетки, в углубление сетчатого ящика на загрузчике образцов и открутите крышку так, чтобы она была свободной и вращающейся (не снимайте). Под жидким азотом снимите крышку с образца патрона большими щипцами и поместите ее под загрузчик образцов. Используйте щипцы для образцов VMXm, чтобы поднять держатель образца на загрузчик образцов, гарантируя, что держатель обращен вверх, чтобы он мог принять сетку. Находясь в правильном положении, небольшой штифт на загрузчике образцов будет взаимодействовать с небольшим отверстием в середине держателя образца. С охлажденными тонкими щипцами осторожно поднимите сетку из коробки сетки и перенесите близко к отверстию сетки на держателе образца. Поверните сетку так, чтобы она лежала ровно (не важно, в какую сторону обращена сторона опорной пленки). Осторожно опустите щипцы так, чтобы сетка была как можно ближе над отверстием сетки (будьте осторожны, чтобы не согнуть сетку) и отпустите сетку в отверстие. Если сетка не сидит должным образом, осторожно используйте тонкие щипцы, чтобы подтолкнуть сетку в нужное положение, или осторожно постучите по держателю образца более крупными щипцами. Быстро поместите предварительно охлажденный инструмент кругового скольжения над сеткой в отверстии сетки и сядите круг, нажав кнопку. Может быть полезно применить 2 углубления кнопки, чтобы убедиться, что круговой круг правильно сидит. Дополнить жидкий азот таким образом, чтобы уровень был примерно на 1,5 см выше держателя образца. Используя щипцы для образцов VMXm, осторожно поднимите держатель загруженного образца вверх и над небольшим штифтом загрузчика образцов и обратно в картридж образца. Обратите внимание на номер положения держателя образца в картридже для образцов. Продолжайте загружать сетки в держатели образцов до тех пор, пока не будут загружены все образцы. Верните блоки сетки в хранилище dewar, если образцы остаются внутри, и удалите загрузчик образцов из dewar, чтобы создать больше места. Замените крышку картриджа, убедив, что штифт в верхней части картриджа взаимодействует с отверстием в крышке. Охладите и заполните воздушный шлюз VMXm dewar жидким азотом и поместите рядом с пеной dewar, содержащей заряженный картридж образца. Используя инструмент для картриджа VMXm, осторожно задействуйте инструмент в гребни сбоку от картриджа и быстро поднимите патрон в воздушный шлюз дьюара. Убедитесь, что уровень жидкого азота покрывает картридж. Поместите крышку на шлюзовой дьюар и пройдите к конечной станции VMXm с заряженным образцом картриджа.ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка картриджа образца в конечную станцию VMXm будет осуществляться персоналом Beamline.

Representative Results

Целью этого протокола является получение остеклованных микрокристаллов с минимальным объемом жидкости, окружающей кристалл, которые позволяют проводить эксперименты по дифракции рентгеновских лучей с минимальным фоновым рассеянием для улучшения дифракционного сигнала. Примеры SEM-изображений микрокристалл, подготовленных на сетках cryoTEM для минимального фонового рассеяния, показаны на рисунках 1A, B и 2. Сетки с равномерно распределенными монокристаллами обеспечат наиболее эффективное использование сетки, с хорошим сигналом-шумом. Однако обычно это невозможно по всей сетке, и некоторые области могут отображать некоторое количество слипания(рисунок 2A, B). Несмотря на это слипание, эти примеры по-прежнему отображают полезное количество моноизолированных кристаллов, которые обеспечат низкую фоновую дифракцию(рисунок 5). Уровень блоттинга, который по-прежнему поддерживает низкий фоновый разброс, может варьироваться. Сильная промокающая так, что отверстия в углеродной опорной пленке хорошо видны, но кристаллы остаются гидратированными, является целью(рисунок 2C, D). Тем не менее, сетки хорошего качества все еще могут отображать некоторую жидкость в отверстиях опорной пленки, хотя положение отверстий все еще должно быть идентифицируемым(рисунок 2A, B). Важно отметить, что все эти примеры отображают одиночные, изолированные кристаллы с оципированным ореолом жидкости, окружающей кристалл, для поддержания гидратации между пятном и погружением замораживания. Многие образцы могут потребовать дальнейшей оптимизации(рисунок 3),которая может включать изменение времени блоттинга или концентрации микрокристаллов. Сетки, перегруженные кристаллами, продемонстрируют снижение эффективности блоттинга и могут привести к тому, что несколько решеток будут записаны на одиночных дифракционных изображениях(рисунок 3A, B). Более вязкие условия кристаллизации, такие как для трипсина, который содержит 8% ПЭГ 4000 и 15% этиленгликоля(рисунок 3C),могут привести к необходимости более длительного времени промокления (>10 с). И наоборот, условия кристаллизации с очень низкой вязкостью, которые очень быстро промокают, могут страдать от проблем с распределением из-за гравитации, вызывающей оседание до того, как произойдет пятно, в результате чего все микрокристаллы оседают вдоль одной стороны сетки(рисунок 3D). Оптимальная подготовка образцов позволяет использовать все возможности VMXm для сбора высококачественных рентгеновских дифракционных данных с максимально возможным разрешением с высоким соотношением сигнал-шум(рисунок 5). Эти образцы выигрывают от совместимости с средой выборки in-vacuo, что приводит к очень низкому или нулевому среднему количеству фона в дифракционных изображениях. Использование жидкого этана без криопротектора приводит к отсутствию ледяных колец(рисунок 5),хотя там, где кристаллы лежат близко к медным стержням решетки, рентгеновский пучок может заглядывать в стержни, что приводит к дифракционным кольцам медного порошка при ~2,1 Å и ~1,8 Å. Рисунок 1:Сравнение микрокристаллического монтажа на микросетчатых креплениях и сетках cyoTEM. Сканируемые электронные микроснимки погруженных замороженных микрокристаллов вируса многогранник размером 2,5 мкм поперек(А, В)напряжение ускорения 5 кВ, размер пятна 39 (произвольные единицы) и время выдержки 16 мкс. Сетка свободна от избытка жидкости(А),вокруг кристаллов наблюдается узкий ореол жидкости(В). Те же образцы, установленные на микросетчатой (20 мкм апертуры) перед вспышкой охлаждения в жидком азоте и наблюдаемые с помощью системы осевого обзора на линии луча I24 лицевой стороной(C)и боковой стороной(D). Оптические искажения(C)при просмотре лицевой стороной дают представление о протяженности толщины жидкости по микросетчатой сетке, это более четко при просмотре микросетки сбоку(D). Красная мишень в C и D представляет положение и размер рентгеновского пучка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2:Примеры образцов хорошего качества. Многогранные кристаллы(A),наблюдаемые на одном квадрате сетки ~100 мкм. В то время как некоторые кристаллы слегка слипаются и показывают некоторую связность окружающей жидкости, существует ряд изолированных монокристаллов с небольшим ореолом жидкости, окружающим кристалл. Немного более крупные кристаллы инсулина(B)размером ~ 5 х 5 мкм также показывают некоторое слипание, но опять же есть хорошо изолированные отдельные кристаллы. Игольчатые кристаллы могут иметь очень узкий размер и требовать микролуча, такого как эти игольчатые кристаллы лизоцима(C). Вокруг этих кристаллов можно увидеть узкую полосу жидкости (светло-серый гало). Более крупные микрокристаллы до десятков микрон также могут быть хорошо установлены на сетках cryoTEM, таких как эти ~ 7 мкм кристаллы протеиназы K(D). Как в(C),так и(D)и в меньшей степени в(A)отверстия углеродной опорной пленки хорошо видны, демонстрируя присутствие очень мало /вообще никакой жидкости. В примере В, хотя пустых отверстий не наблюдается, положение отверстий все еще может быть идентифицировано, что указывает на то, что жидкость только заполняет отверстия в опорной пленке. Во всех этих примерах ореол жидкости можно увидеть вокруг края квадрата сетки (округлый внутренний квадрат), где отверстия имеют более светло-серый вид. Это общая черта хорошо подготовленных сеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3:Примеры образцов, требующих дальнейшей оптимизации. Сетки, перегруженные микрокристаллами(А, В),могут увеличивать фоновое рассеяние, так как образцы блокируют отверстия в опорной пленке, снижая эффективность промокления, а при более высоком поверхностном натяжении между кристаллами остается больше жидкости. Помимо деградации сигнал-шум, приводящей к потере информации, вполне вероятно, что будут записаны несколько решеток. Использование времени промокания, которое недостаточно долго, или высоковязкого кристаллизационного раствора может привести к чрезмерно влажному образцу(C),также производящего низкий уровень сигнал-шум. Условия кристаллизации без осадителей, такие как условия для быжьего инсулина(D),имеют очень низкую вязкость. Хотя это приводит к очень короткому времени промоктирования, это также может привести к движению кристаллов по сетке до и во время пятнистости из-за воздействия гравитации. Это обычно приводит к в значительной степени пустой сетке с высокой концентрацией кристаллов вдоль одного края(D). Может быть выгодно добавлять вязкий агент, такой как этиленгликоль, в кристаллическую суспензию незадолго до нанесения их на сетку, чтобы уменьшить поток кристаллов и улучшить распределение кристаллов. Это также может удлинить время блоттинга, что облегчает наблюдение за блоттингом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4:Инструменты для загрузки образцов в VMXm. Для загрузки держателей образцов VMXm(A)был разработан индивидуальный набор инструментов. Загрузчик образцов(B)имеет место для одного держателя образца VMXm, коробки сетки и хранения инструмента во время работы. Он также предназначен для работы чуть ниже поверхности жидкого азота и позволяет картриджу образца поместиться под ним(B). Воздушный шлюз dewar(C),который подходит к газовой коробке с азотом на конечной станции VMXm, используется для взятия загруженного картриджа образца из лаборатории в экспериментальную хотчу. Для просмотра образцов в автономном SEM был изготовлен изготовленный на заказ шаттл(D),состоящий из держателя образца VMXm без основания, чтобы обеспечить оценку в держателе образца, который используется на линии луча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Пример дифракции от микрокристаллов в VMXm. Одно дифракционное изображение, записанное с помощью детектора Pilatus 3 6M на VMXm многогранного кристалла вируса ~3 мкм, установленного на сетке cryoTEM с использованием метода погружного замораживания. Дифракция наблюдается выше 1,7 Å, а отражение (синий квадрат) при 1,74 Å является вставкой, демонстрирующей низкий фоновый разброс с большим количеством пикселей с нулевыми значениями. Этиленгликоль до конечной концентрации 50% v/v добавляли к кристаллической суспензии перед нанесением ее на сетку. Низкий фоновый характер положения образца VMXm демонстрируется постоянным фоном по всему изображению, как показано интенсивностью, нанесенной под синей пунктирной линией, даже вблизи центра луча. Построенная интенсивность показывает, что фон остается ниже 3 отсчетов. Наблюдаются два слабых кольца при 2,15 Å и 1,86 Å, которые генерируются порошковой дифрацией меди сетки cryoTEM. Отсутствуют обнаруживаемые ледяные кольца, демонстрирующие эффективность промокления с последующим охлаждением жидким этаном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Этот протокол демонстрирует, как инструменты из пробоподготовки cryoTEM могут быть использованы для подготовки микрокристаллов для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей на линиях пучка микрофокуса. Стандартные приборы лучевой линии сосредоточены вокруг установленного на штифте образца, и, хотя были предприняты усилия для обеспечения поддержки образца на этих креплениях для микрокристаллов, их часто сложно загрузить образцом, гарантируя при этом достижение самого высокого уровня сигнал-шум(рисунок 1C, D). Многие из этих образцов могут также потребовать оптимизации условий криозащиты, чтобы убедиться, что образец стекловидного. Метод погружной заморозки обеспечивает повторяемый способ удаления лишней жидкости и мгновенного охлаждения образца в эффективномкриогене (рисунок 1A, B). В то время как сетка может быть установлена на стандартной линии луча с помощью пинцета на основе штифтового крепления, держатели образцов VMXm были специально разработаны для приема решеток и удержания их ниже температуры стеклования в вакуумной среде посредством проводящего охлаждения. Выборонная среда VMXm обеспечивает сбор данных с низким фоном, где образец является оставшимся источником фона, и обеспечивает микролуч, который можно использовать для сопоставления кристаллов с размерами менее 10 мкм. Этот метод пробоподготовки также может быть использован для подготовки нанокристаллов к дифракции электронов, где также требуется очень мало избыточной жидкости и стекловидного тела из-за слабого проникновения электронов. В то время как сетки cryoTEM хрупки, те, кто занимается сбором кристаллов в петлях, быстро адаптируются к обработке сеток. При небольшом количестве опыта несколько сеток будут потеряны во время этапов промокания, замораживания и загрузки протокола. Однако шаги оптимизации имеют решающее значение для этого успеха, и тщательная подготовка уменьшит вероятность потери кристаллов или снижения целостности кристаллов.

Сетки CryoTEM обеспечивают относительно большое одиночное крепление, которое может содержать многие сотни кристаллов, тем самым повышая пропускную способность, где можно записать только небольшой клин дифракционных данных. Одна сетка может также обеспечить достаточное количество кристаллов для определения структуры белка, особенно в кристаллах высокой симметрии. В тех случаях, когда только одна или две капли монокристаллизации привели к микрокристаллу, только пробное промокание состояния кристаллизации может помочь гарантировать, что при смачивании микрокристаллов используемое время максимально приближено к тем, которые необходимы для создания исходных образцов хорошего качества. Опоры из углеродной пленки невидимы для рентгеновских лучей и доступны с различным расстоянием между отверстиями, которые могут быть использованы в соответствии с определенной морфологией. Чаще всего мы используем опорные пленки с отверстиями 2 мкм на расстоянии 2 мкм, но меньшие отверстия с большим расстоянием могут быть более подходящими для кристаллов менее 2 мкм. Доступны другие опорные пленки, такие как пленки с отверстиями 1 мкм с расстоянием 4 мкм, а также опорные пленки с отверстиями различной формы, все из которых будут влиять на время промокания. Квадратная сетка размером 200 (200 квадратов на дюйм) также обеспечивает достаточно места (~ 100 мкм) между медными стержнями сетки, чтобы рентгеновский луч не сильно взаимодействовал с медью, обеспечивая при этом достаточную структурную поддержку для углеродной пленки, загруженной кристаллами. Использование жидкого этана сводит на нет потребность в криопротекторах, что, в свою очередь, снижает требования к объему образца, которые использовались бы при оптимизации криопротекторных условий.

Основными параметрами, которые необходимо оптимизировать в процессе, являются время промокления и разбавление образца. Время промокания должно быть достаточно длинным, чтобы наблюдать эффект «хлопка» по всей сетке до погружения в замерзание. Чрезмерное промокание может привести к обезвоживанию кристаллов, однако контроль влажности в камере образца используется для минимизации этого эффекта. Хотя предполагается, что используется относительная влажность 90%, некоторые образцы могут извлечь выгоду из оптимизации влажности. Влажность может повлиять на эффективность промокательной бумаги, которая может медленно насыщаться водой. Кроме того, контроль влажности в камере образца может быть использован для улучшения дифракционного качества кристаллов30. Рекомендуется внести небольшие изменения (<5%) влажности перед проверкой дифракционной целостности, чтобы убедиться, что качество дифракции не ухудшается.

Оптимизация недрагоценных образцов может проводиться с помощью светового микроскопа вместо SEM. Несмотря на деструктивность, он полезен для оценки плотности кристаллов по всей сетке и для принятия решения о том, следует ли разбавлять или концентрировать образец для лучшего диспергирования кристаллов по всей сетке. Этот шаг наиболее полезен, когда имеется большое количество кристаллов и особенно высококонцентрированные образцы. Следует избегать слипания кристаллов(рисунок 3),так как, хотя это не является существенной проблемой, если два кристалла освещаются одновременно во время сбора данных6,вероятно, будет больший объем жидкости, окружающей сгусток, тем самым уменьшая сигнал-шум(рисунок 5). Хотя можно наблюдать большие избытки жидкости глобально по всей сетке с помощью светового микроскопа, оценка объема жидкости, окружающей микрокристаллы, и присутствия кристаллического льда может быть произведена только с помощью электронного микроскопа, оснащенного криогенной системой вакуумного переноса и ступенью. Иногда, после нанесения кристаллов на сетку и до того, как происходит промокание, кристаллы в растворах с низкой вязкостью могут оседать вдоль одного края сетки. Мы обнаружили, что добавление до 50% конечной концентрации этиленгликоля может замедлить движение кристаллов через каплю, обеспечивая лучшее распределение микрокристаллов по сетке, а также обеспечивая больший контроль над блоттингом за счет увеличения времени промоктирования(рисунок 3D).

Некоторые кристаллизационные растворы, содержащие вязкие осадители, такие как высокомолекулярные ПЭГ, могут оказаться сложными для промоктирования, требуя все более длительного времени промоктирования (>10 с). В таких случаях может быть полезно уменьшить объем жидкости, осажденной на задней части сетки, а также объем кристаллического раствора на стороне опорной пленки сетки. Такие стратегии, как использование 2 слоев промокатурной бумаги или стеклянных волокон, также могут помочь в этом сложном случае31.

Хотя этот конвейер подходит для растворимых белковых кристаллов, те, которые образуются в очень вязких средах, таких как мембранные белки в LCP, представляют собой другую проблему, для которой этот протокол не подходит. Тем не менее, появляются стратегии подготовки кристаллов LCP на сетках cryoTEM для microED, которые включают снижение вязкости образцов путем индуцирования фазового изменения lcp. Это позволяет наносить образцы на сетки аналогично тому, что описано в этой статье. Наконец, образец может быть измельчен сфокусирован ионным пучком для удаления излишков некристаллического материала32,33,34.

В целом, этот трубопровод, как правило, занимает 1-2 ч (включая время настройки оборудования), чтобы проследить от образца, поступающего в VMXm, до обеспечения оптимизированных сеток хорошо диспергированными, остеклованными образцами, в зависимости от наличия образцов, концентрации кристаллов и вязкости кристаллизационного раствора. Эти методы уже успешно применяются для подготовки микрокристаллов для рентгеновских дифракционных экспериментов, изучающих радиационное повреждение микрокристаллов, где минимальный объем жидкости, окружающей образец, был существенным28,35. Следует отметить, что протокол может быть применен ко всем растворимым микрокристаллическим образцам, а не только к хорошо дифрактируемым образцам, которые уже были оптимизированы. Эксперимент по кристаллизации, который производит микрокристаллический материал, традиционно будет целью для оптимизации с целью получения более крупных кристаллов, однако этот метод подготовки образцов и возможности VMXm могут позволить собирать адекватные данные из таких образцов без дальнейшей оптимизации. В качестве альтернативы, если такие микрокристаллические образцы плохо дифрагированы, данные, собранные из VMXm с использованием этого метода пробоподготовки, могут по-прежнему служить полезным руководством для дальнейшей оптимизации условий кристаллизации. Инструменты для подготовки сеток, включая разгрузку накаливания и погружную заморозку, в настоящее время широко доступны в научно-исследовательских институтах, оборудованных для экспериментов криотем, и будут доступны многим пользователям, что позволит им готовить образцы до начала времени луча на VMXm.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Джереми Киоуна, Джона Граймса, Джеффа Саттона и Дэйва Стюарта, Strubi University of Oxford и Rachel Bolton, Университет Саутгемптона, за любезное предоставление микрокристаллических образцов для разработки и демонстрации методов подготовки образцов для лучевой линии VMXm в дополнение к возможности ввода в эксплуатацию лучевой линии. Авторы также хотели бы поблагодарить iNEXT-Discovery (номер проекта 871037) за возможность и поддержку в публикации этой рукописи.

Materials

Automated Cryo-EM plunge freezing instrument Leica or ThermoFisher Various
Benchtop light microscope with light source Various Various
Blade/Scalpel Fisher Scientific Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes Quantifoil N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes Agar Scientific AGG3727
ddH2O n/a n/a
Ethane gas supply n/a n/a
Ethylene Glycol Acros Organics 146750010
Glass microscope slides FisherBrand 12383118
Glass petri dish FisherBrand 455732
Glow discharging device Pelco 91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm) Bemis HS234526B
Large and small, fine forceps Agar Scientific Various
Liquid nitrogen supply n/a n/a
Pipette tips Various Various
Pipetting devices Various Various
Sealing tape for crystallisation plates. Molecular Dimensions MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars Spearlab Various
Sprung circlip clipping tool Subangstrom SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper Leica 16706440
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).
  15. . MiTeGen Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020)
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

Tags

AI-assisted Sample PreparationMicrocrystal HandlingCryoTEM Grid PreparationPlunge FreezingBackground ReductionX-ray DiffractionSample BlottingCrystallization Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Crawshaw, A. D., Beale, E. V., Warren, A. J., Stallwood, A., Duller, G., Trincao, J., Evans, G. A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline. J. Vis. Exp. (172), e62306, doi:10.3791/62306 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image