JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

Published: June 17, 2021
doi:
10.3791/62306
, , , , , ,
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council,Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute,Harwell Science and Innovation Campus

Summary

De signaal-ruisverhouding van gegevens is een van de belangrijkste overwegingen bij het uitvoeren van röntgendiffractiemetingen vanaf microkristallen. De VMXm beamline biedt een geluidsarme omgeving en microbeam voor dergelijke experimenten. Hier beschrijven we monstervoorbereidingsmethoden voor het monteren en koelen van microkristallen voor VMXm en andere microfocus macromoleculaire kristallografiebundellijnen.

Abstract

De montage van microkristallen (<10 μm) voor cryokristallografie met één kristal vormt een niet-triviale uitdaging. Verbeteringen in gegevenskwaliteit zijn gezien voor microkristallen met de ontwikkeling van beamline-optica, bundelstabiliteit en variabele bundelgrootte gericht van submicron tot microns, zoals bij de VMXm-bundellijn bij Diamond Light Source1. Verdere verbeteringen in de kwaliteit van de gegevens zullen worden bereikt door verbeteringen in de monsteromgeving en monstervoorbereiding. Microkristallen genereren inherent zwakkere diffractie, daarom is het verbeteren van het signaal-naar-ruis de sleutel tot het verzamelen van hoogwaardige röntgendiffractiegegevens en zal voornamelijk afkomstig zijn van vermindering van achtergrondruis. Belangrijke bronnen van röntgenachtergrondruis in een diffractie-experiment zijn hun interactie met het luchtpad voor en na het monster, overtollige kristallisatieoplossing rond het monster, de aanwezigheid van kristallijn ijs en verstrooiing van andere bundellijninstrumentatie of röntgenvensters. De VMXm beamline bestaat uit instrumentatie en een monstervoorbereidingsprotocol om al deze geluidsbronnen te verminderen.

Ten eerste verwijdert een in-vacuüm monsteromgeving bij VMXm het luchtpad tussen röntgenbron en monster. Vervolgens maken monstervoorbereidingsprotocollen voor macromoleculaire kristallografie bij VMXm gebruik van een aantal processen en hulpmiddelen die zijn aangepast van cryoTEM. Deze omvatten koperen roosters met gatenachtige koolstofondersteuningsfilms, geautomatiseerde delotting en plunge cooling robotica die gebruik maken van vloeibaar ethaan. Deze tools maken de voorbereiding van honderden microkristallen op een enkel cryoTEM-raster mogelijk met minimale omringende vloeistof op een geluidsarme ondersteuning. Ze minimaliseren ook de vorming van kristallijn ijs uit de resterende vloeistof rond de kristallen.
We presenteren het proces voor het voorbereiden en beoordelen van de kwaliteit van oplosbare eiwitmicrokristallen met behulp van zichtbaar licht en scanning elektronenmicroscopie voordat de monsters op de VMXm-bundellijn worden gemonteerd voor röntgendiffractie-experimenten. We zullen ook voorbeelden geven van monsters van goede kwaliteit, evenals monsters die verdere optimalisatie en strategieën vereisen om dit te doen.

Introduction

Een belangrijke barrière voor de bepaling van hoge-resolutie structuren van biologische moleculen door macromoleculaire kristallografie (MX) blijft de productie van goed diffracterende kristallen op een bruikbare grootte. Er zijn veel strategieën om dit doel te bereiken, van het ontwerp van recombinant eiwitgenconstructen tot grote schaarse matrixzoekopdrachten voor chemische cocktails die initiële kristallen kunnen genereren2. Voor dit laatste is het vaak zo dat de kristallograaf eventuele initiële treffers moet optimaliseren om kristallen te verkrijgen met voldoende diffractiekwaliteit en -grootte voor structuurbepalingsstudies3. Ondanks deze opties kunnen sommige doelmoleculen nooit grote (>10 μm) goed diffracterende kristallen genereren en als gevolg daarvan moet de kristallograaf volharden in hun microkristallen en de uitdagingen die dergelijke monsters met zich meebrengen. Deze omvatten het op de juiste manier monteren en cryo-beschermen van de kristallen, het beheren van inherent zwakkere diffractie en verhoogde stralingsgevoeligheid. Microkristallen worden gevormd uit minder eenheidscellen en moleculen dan grotere kristallen en als zodanig wordt de diffractie niet in dezelfde mate versterkt in vergelijking met grotere kristallen, wat resulteert in inherent zwakkere diffractie-intensiteiten. Het is belangrijk dat het achtergrondsignaal deze reflecties niet maskeert, vooral bij een hogere resolutie waar zwakke reflectie-intensiteiten verloren kunnengaan 4. Bovendien zijn microkristallen gevoeliger voor stralingsschade en ondanks het registreren van diffractie bij vloeibare stikstoftemperaturen5, is het mogelijk niet mogelijk om volledige gegevens van een enkel kristal te verzamelen, waardoor het noodzakelijk is om gegevens van een zeer groot aantal kristallen te verzamelen om een enkele volledige dataset te produceren6.

De toenemende beschikbaarheid van röntgenvrije elektronenlasers (XFET’s) en de evolutie van seriële kristallografiemethoden (SFX)7 hebben routes geboden voor het verzamelen van gegevens van kleinere microkristallen. Dit zijn echter op maat gemaakte monsterafgiftemethoden, die een aanzienlijke hoeveelheid hardware- en software-expertise vereisen, waarbij experimenten beperkt zijn tot kamertemperatuur en het monsterverbruik doorgaans hoog is (honderden microliters) en nog steeds verdere optimalisatie vereist8. Als zodanig zijn projecten waarbij slechts een beperkte hoeveelheid microkristallen kan worden gemaakt, niet geschikt voor SFX.

Ondertussen is de synchrotron beamline-technologie in de afgelopen decennia geëvolueerd om kleinere, stabielere bundels9 te produceren met een schittering die het mogelijk heeft gesteld gegevensverzameling van steeds kleinere kristallen10,11. Microfocus beamlines zoals FMX bij NSLS-II en I24 bij Diamond Light Source zijn in staat geweest om nieuwe structuren te bepalen uit kristallen met maximale afmetingen van ~ 3 μm12 en het vermogen aantonen om bruikbare gegevens te verzamelen van nog kleinere kristallen van ~ 1 μm13. De beamline moet nauwkeurig worden geconfigureerd, met uitstekende, hoge resolutie on-axis-viewing optiek, een minimale sfeer van verwarring voor monsterrotatie en een nauwkeurig uitgelijnde rotatieas die samenvalt met de röntgenstraal. Het is belangrijk om het röntgenstraalprofiel nauw af te stemmen op het kristalvolume en ervoor te zorgen dat het kristal nauwkeurig is uitgelijnd in de röntgenstraal – een uitdaging voor kristallen <5 μm14. Het voldoen aan deze experimentele omstandigheden aan de beamline is essentieel voor het vastleggen van de beste kwaliteit gegevens van microkristallen.

Het resterende en misschien wel belangrijkste aspect van gegevensverzameling van microkristallen is de presentatie van het kristal aan de röntgenstraal. Microkristallen zijn vaak gemonteerd op micromesh-monsterbevestigingen, vervaardigd uit polyimide, een materiaal met lage röntgenverstrooiing met openingen zo klein als 10 μm15,16. Het polyimide gaas is gemonteerd op een standaard pin die is ingesteld in een magnetische SPINE-basis, waardoor het compatibel is met de meeste MX-beamlines17. De mesh-houder wordt gebruikt om kristallen uit de kristallisatiedruppel te vissen, vaak volgens dezelfde procedure als het monteren van een kristal van 100 μm met behulp van een standaard lusvormige houder. Hoewel de kristallen over het gaas kunnen worden verdeeld, is een belangrijk nadeel dat een relatief groot volume vloeistof tijdens het oogsten door het gaas en de pin kan worden gedragen(figuur 1C,D). Dit volume vloeistof, dat vele malen groter kan zijn dan de kristallen zelf, zal bijdragen aan achtergrondgeluid wanneer het wordt verlicht met röntgenstralen. Deze achtergrondverstrooiing kan nog sterker zijn als de vloeistof kristallijn ijs vormt tijdens flitskoeling, waardoor de signaal-ruisverhouding van reeds zwakke intensiteiten binnen de resoluties van ijsdiffractie afneemt. Daarom is het belangrijk dat overtollige vloeistof uit het monster wordt verwijderd, om ervoor te zorgen dat alle mogelijke signalen kunnen worden geregistreerd. Deze uitdaging is nog groter in het geval van membraaneiwitkristallen gevormd in de lipide kubieke fase (LCP), waar de LCP sterke achtergrondverstrooiing genereert en ook moeilijk te verwijderen is rond de kristallen 18.

De nieuwe Versatile Macromolecular Crystallography microfocus (VMXm) beamline bij Diamond Light Source biedt de voorwaarden om gegevens te verzamelen van kristallen die mogelijk minder dan een micron groot zijn. De beamline is ontworpen om een bundelprofiel van 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1,een goniometer met een verwarringssfeer van niet groter dan 60 nm en een in vacuo monsteromgeving te leveren. Deze ontwerpkenmerken van het VMXm-eindstation minimaliseren het genereren van achtergrondgeluid door het beamline-apparaat tijdens het verzamelen van gegevens met de grootste resterende achtergrondbron gegenereerd door het monster14.

Specifieke monstervoorbereidingsmethoden die zijn ontworpen voor de VMXm-beamline bieden de mogelijkheid om deze achtergrond te verminderen en het signaal-ruis van diffractiegegevens verder te verbeteren, waardoor de kwaliteit van de gegevens die kunnen worden geregistreerd van microkristallen met een < 10 μm wordt gemaximaliseerd. Veel van de hier geschetste vereisten voor lage achtergronddiffractie van microkristallen zijn ook gebruikelijk voor cryogene transmissie-elektronenmicroscopie (cryoTEM)19 en microkristal-elektronendiffractie (microED)20. Als gevolg hiervan zijn veel van de tools die al zijn ontwikkeld voor de bereiding van cryoTEM-monsters geschikt, met enkele aanpassingen, voor de bereiding van microkristallen. Bij de voorbereiding van monsters voor cryoTEM met één deeltje zijn de onderzochte deeltjes ingebed in zeer dunne lagen (meestal <100 nm) glasachtig ijs, zodat elektronen door het monster kunnen verzenden. De dunne uniforme laag wordt bereikt door overtollige vloeistof weg te deppen en vitrificatie van het monster wordt bereikt door snelle afkoeling van het monster (~ 104 K s-1)21 door te storten in vloeibaar ethaan dat wordt vastgehouden op ~ 93 K22. Vloeibare stikstof daarentegen, zoals routinematig gebruikt voor mx-monstervoorbereiding, is een minder efficiënt cryogeen dan ethaan en heeft een grotere neiging tot kristallijne ijsvorming in het monster21. De vorming van kristallijn ijs, dat diffractie kan afbreken en achtergrondgeluid kan genereren, wordt normaal gesproken beperkt door het gebruik van cryo-beschermende verbindingen23. Polymeren met een laag molecuulgewicht zoals poly-ethyleenglycol (PEG) 400 en methyl-2,4-pentanediol (MPD), suikers, oliën of verzadigde zouten kunnen in lage concentraties aan een aliquot kristallisatieoplossing worden toegevoegd24– er is geen ‘one size fits all’-oplossing voor het selecteren van de meest geschikte cryoprotectant en dit vereist vaak optimalisatie25 . Het kristal ondergaat ook meerdere manipulaties tijdens het oogst- en cryo-beschermende proces dat kan leiden tot schade aan het kristal, de mogelijkheid om vloeibaar ethaan te gebruiken maakt het weglaten van deze stap mogelijk en helpt de integriteit van het kristal te beschermen.

Hoewel vloeibaar ethaan een effectief cryogeen is voor microkristallen (<10 μm) vanwege de dunheid van het monster, zijn er alternatieve methoden om kristallijne ijsvorming te voorkomen, met name in grotere kristallen, waaronder het verminderen van het watergehalte van het kristal door gebruik te maken van een streng gecontroleerde vochtige omgeving26, of door het afvoeren van overtollige vloeistof weg van zowel de lus als het oppervlak van het kristal27 , maar deze vereisen opnieuw een grotere manipulatie van het monster. Het gebruik van geautomatiseerde blotting en plunge freezing met vloeibaar ethaan, zoals in cryoTEM, verwijdert samen overtollige kristallisatieoplossing en biedt een middel om koele microkristallen op een gecontroleerde manier te flitsen terwijl wordt geprobeerd manipulatie te minimaliseren.

Hier presenteren we een protocol dat niet alleen kan worden gebruikt door zowel gebruikers van de VMXm-beamline als bij andere microfocus-beamlines om hoge signaal-naar-ruis diffractiegegevens te verzamelen, maar ook nuttig kan zijn voor diegenen die oplosbare eiwitkristal- en wasmiddelgebaseerde membraaneiwitkristalmonsters bereiden voor microED-experimenten. Hoewel alle faciliteiten voor het voorbereiden en beoordelen van monsters beschikbaar zijn bij VMXm, zijn veel structurele biologielaboratoria in toenemende mate uitgerust voor cryoTEM-monstervoorbereiding. Als gevolg hiervan voorzien we dat sommige gebruikers hun eigen faciliteiten willen gebruiken om hun monsters voor te bereiden op beamtime bij VMXm.

Protocol

1. Apparatuur instellen OPMERKING: De hier beschreven methoden gebruiken een plunge freezing-instrument met een enkele vloeiarm. Sommige instrumenten zijn uitgerust met twee deparmen en we raden de gebruiker aan om de instructies van de fabrikant te controleren om het instrument zo aan te passen dat er slechts één debendearm in gebruik is. Zorg ervoor dat een lichtmicroscoop in de buurt van het invriesinstrument is geplaatst, idealiter zodat zowel de microscoop als de dompelvriezer binnen handbereik van de gebruiker zijn. Stel de automatische dompelvriezer in en koel deze volgens de instructies van de fabrikant.OPMERKING: De temperatuur van de monsterkamer moet worden ingesteld op de temperatuur waarbij de kristallen zijn gekweekt. Plaats geen vloeipapier in de monsterkamer.LET OP: Vloeibaar ethaan is een licht ontvlambaar explosief en mag alleen worden gebruikt in een goed geventileerde ruimte uit de buurt van potentiële vonkbronnen. Label rasterdozen op de juiste manier en koel ze in een kleine dewar met behulp van vloeibare stikstof. Plaats zorgvuldig roosters, koolstoffilm met de zijkant naar boven, op een geschikte drager voor gloedafladen (zoals een glazen microscoopglaasje gewikkeld in parafilm). Gloei cryoTEM roosters gedurende 25 s bij 0,39 mBar, met een stroom van 15 mA. Gloedontlading vlak voordat de roosters worden gebruikt. Bewaar de gloed ontladen roosters in een afgedekte petrischaal tot ze klaar zijn; als 30 minuten vergaat na gloedontlading, herhaalt u de gloedafvoer.OPMERKING: Met de dompelvriezer klaar en roosters voorbereid, kan de aandacht naar het monster gaan. 2. Bepalen van initiële blotting parameters Stel de relatieve vochtigheid van de monsterkamer in op 90% en de debatietijd op 5 s en zorg ervoor dat de dompelvriezer is ingesteld om het monster automatisch te dompelen nadat het dempen is voltooid.OPMERKING: Deze startparameters zijn het meest geschikt voor de Leica GP plunge freezer, andere parameters zoals blotting force zijn beschikbaar op de FEI Vitrobot. In onze ervaring is het echter waarschijnlijker dat de kristalintegriteit wordt gehandhaafd door het gebruik van een enkele vloeiarm. Om de kristallisatiebak te kunnen afdichten zodra de put van belang is geopend, snijdt u een kleine strook tape en vouwt u over het ene uiteinde om een lipje te maken om het openen van de afdichting te vergemakkelijken en voorzichtig aan één kant te plaatsen. Knip de afdichting over de kristallisatieput open, inclusief het reservoir. Werk snel en breng 2-5 μL reservoiroplossing aan op de kristalhoudende druppel om het vloeistofvolume in de druppel te behouden. Gebruik het lipje tape om vervolgens het putje opnieuw te openen en ervoor te zorgen dat de kristallisatiedruppel niet uitdroogt. Terwijl u de tape tijdelijk openhoudt over de kristallisatieput, brengt u 10 μL van de reservoiroplossing over naar een buis van 0,5 ml om te gebruiken voor latere stappen. Hersluit de put. Plaats een stuk voorgesneden vloeipapier op de deppenarm van het instrument voor het invriezen. Plaats een enkel gloeiend ontladen rooster in de sprongvrieskloten en laad het instrument zodanig in dat de koolstofzijde weg van de deppende arm is gericht. Zorg ervoor dat de relatieve luchtvochtigheid in de detkamer op 90% ligt. Draai de tang zodat de koolstoffilmzijde naar de deppende arm is gericht. Breng met een pipet van 2,5 μL 2 μL reservoiroplossing aan van de buis van 0,5 ml naar de niet-ondersteunende (glanzend koperen) kant van het cryoTEM-raster. Draai het rooster zo dat de koolstofsteunzijde weg is van de deppende arm en herhaal het proces, waarbij u de vloeistof voorzichtig op de koolstoffilmsteunzijde van het rooster aanbrengt. Vermijd het aanraken van de koolstoffilm met de pipetpunt om de koolstoffilm niet te beschadigen. De vloeistof moet zich over het net verspreiden vanwege de lading die wordt afgezet tijdens het ontladen van de gloed. Start het vloeiproces terwijl u het raster observeert. Hiervoor is op de Leica GP2 een kijkkijker beschikbaar. Observeer of de vloeistof gedurende deze tijd uit het koolstofoppervlak van het rooster wordt getrokken, dit begint met het grootste deel van de vloeibare bolus op het rooster dat afvlakt als de vloeistof door het rooster wordt geloosd. Naarmate de vloeistof in elk rastervierkant verder wordt verminderd, kan een golf van ‘knallen’ over het oppervlak van het raster worden waargenomen. Als dit effect wordt waargenomen, kan het afvegen worden gestopt binnen 2-3 s na het einde van het popping-effect. Het is niet nodig om het testrooster te storten dat kan worden weggegooid. Als het zogenaamde ‘popping’-effect niet wordt waargenomen, herhaalt u stap 2.11-2.14, waarbij de blottingtijd telkens met 1-2 s wordt verlengd totdat het popping-effect wordt waargenomen net voordat de vloeiarm zich van het rooster terugtrekt. Let op deze tijd voor stap 3.OPMERKING: Het is belangrijk dat het depen stopt zodra dit knallende effect is opgetreden om ervoor te zorgen dat kristallen tijdens het proces niet uitgedroogd raken door over-depen. Gebruik de kristallisatieoplossing uit het reservoir voor terugdemping en verdunning van het monster, omdat het ervoor zorgt dat de kristallen worden onderworpen aan een consistente oplossing, waardoor het risico op destabilisatie van de kristallen wordt verminderd. 3. Kristallen oogsten Plaats de kristallisatieplaat onder de lichtmicroscoop en plaats het doelwit ruim binnen het gezichtsveld. Plaats een vers, gloeiend ontladen rooster in de dompelvriezer en monteer de tang in de dompelvriezer, met de koolstoffilmzijde weg van de deppende arm. Draai de tang zodat de koolstoffilmzijde naar de deppende arm is gericht. Breng met behulp van een pipet van 2,5 μL 2 μL reservoiroplossing aan van de buis van 0,5 ml naar de niet-ondersteunende kant van het cryoTEM-raster en draai het rooster zodat de koolstoffilmondersteuningszijde naar de monsterpoort van de dompelvriezer is gericht. Pel de tijdelijke afdichting af en met de pipet ingesteld op 2 μL, aspirateer de kristallisatiedruppel herhaaldelijk voorzichtig om de microkristallen op te hangen (het is belangrijk om geen luchtbellen in de druppel te introduceren).OPMERKING: Het is van cruciaal belang om dit proces onder de lichtmicroscoop te observeren om ervoor te zorgen dat kristallen vrijkomen uit elke oppervlaktehuid of de basis van de put. Als de kristallen vastzitten en niet met aspiratie zijn opgesteld, kan de pipetpunt of andere kristallisatiehulpmiddelen zoals een acupunctuurnaald worden gebruikt om de kristallen voorzichtig los te maken. Afhankelijk van de grootte van de kristallen en de scherptediepte van de lichtmicroscoop is het soms mogelijk om met de microscoop de kristallen te bekijken die de pipetpunt binnenkomen. Breng 2 μL van de aangezogen microkristaldrijfmest over naar de dompelvriezer en breng al het monster aan op de koolstofzijde van het cryoTEM-rooster. Dep voor de tijd bepaald in stap 2 en start onmiddellijk met het invriezen. Let tijdens het vlekken op het optreden van een knallend golfeffect over het raster en noteer of dit volledig over het raster is gebeurd. De aanwezigheid van kristallen kan de initiële deiningstijd beïnvloeden en dit moet mogelijk worden aangepast voor volgende rasters met 1-2 s. Werk snel en breng het rooster over van het vloeibare ethaan naar de roosterbox ondergedompeld in vloeibare stikstof. Restethaan kan veranderen in een ondoorzichtige witte vaste stof op het rooster wanneer het in vloeibare stikstof terechtkomt. Om dit te verminderen, verwijdert u het rooster gestaag uit het vloeibare ethaan en brengt u het vervolgens snel over naar het reservoir met vloeibare stikstof. Zodra 4 roosters in de rasterdoos zijn geplaatst, bevestigt u het deksel van de doos met de schroef en breng u deze over naar een schuimdewar van vloeibare stikstof om verdere monsterbeoordeling mogelijk te maken met een scanning elektronenmicroscoop (SEM) of naar een opslag van vloeibare stikstof met behulp van een geschikte opslagcontainer. 4. Beoordeling van de monsterdichtheid door lichtmicroscopie LET OP: Deze methode is destructief. Als er beperkte beschikbaarheid van monster is, zoals slechts één of twee kristallisatiedruppels, wordt aanbevolen deze stap over te slaan. Na het invriezen van monsters (stap 3.7) kan de verdeling van kristallen over het raster worden beoordeeld. Monteer een droog cryoTEM-rooster op kamertemperatuur in de duikvriezer tang en plaats de tang op hun kant op de lichtmicroscoop, met het raster in het gezichtsveld. Stel een geschikte vergroting en focus in, zodat het hele raster en de afzonderlijke rastervierkanten kunnen worden opgelost. Volg de stappen 3.1-3.7. In plaats van het rooster over te brengen naar de roosterdoos (stap 3.8), trekt u het ondergedompelde rooster terug uit het vloeibare ethaan door de dompelvriezer opnieuw in te stellen.LET OP: Het rooster en monster warmen op tot kamertemperatuur en kunnen niet worden gebruikt voor verdere diffractie-experimenten. Verwijder de tang van het instrument voor het invriezen van de duik. Terwijl u het raster in de tang houdt, plaatst u het raster onder de lichtmicroscoop – de focus is al ruwweg ingesteld. Voer een fijne focus uit en beoordeel de dichtheid van de kristallen over het raster. Een goed raster bevat verschillende geïsoleerde kristallen weg van de rasterbalken binnen elk rastervierkant en het klonteren van kristallen is minimaal. Wanneer de dichtheid van kristallen binnen het raster resulteert in samenklonteren van kristallen met slechts een paar geïsoleerde kristallen, verdunt u de kristalbrij verder met reservoiroplossing en herhaalt u stap 3. Wees voorzichtig bij het verdunnen van monsters, zodat de verdunning niet resulteert in het oplossen van de kristallen. Verdun de kristallen in stappen met kleine volumes van 0,5-1 μL. 5. Monsterbeoordeling door scanning elektronenmicroscopie OPMERKING: Microkristalpreparaat op cryoTEM-roosters kan het beste worden beoordeeld met een scanning elektronenmicroscopie (SEM) onder cryogene omstandigheden, dit kan worden bereikt met een SEM uitgerust met een cryo-fase. Bij VMXm wordt gebruik gemaakt van een JEOL JSM-IT100 SEM (wolfraambron) met een Quorum PP3006 luchtsluis en cryostage. Om minimale stralingsschade te garanderen bij het bekijken van monsters op VMXm28,29,worden de volgende instellingen gebruikt: 5 kV versnellende spanning; een spotgrootte van 40 (willekeurige eenheden op de JEOL JSM-IT100); 10 mm werkafstand. Beelden worden opgenomen met behulp van de secundaire elektronendetector, voor monsteruitlijning en focus wordt een verblijftijd van 0,8 μs gebruikt, terwijl hoge resolutie beelden van enkele kristallen worden vastgelegd met een verblijftijd van 16 μs. Het is belangrijk voordat u een monster in de SEM laadt dat de microscoop is uitgelijnd volgens de instructies van de fabrikant. Er wordt geadviseerd om slechts één rooster in de SEM te laden, terwijl alle resterende rasters die met dezelfde parameters zijn voorbereid, zijn gereserveerd voor röntgendiffractie-experimenten. Bereid de SEM voor door de cryofase van het monster te koelen tot -180 °C volgens de instructies van de fabrikant. Volg de instructies voor het laden van cryoTEM-roosters in het specifieke beschikbare systeem. Terwijl het monster in de SEM is geladen, schakelt u de elektronenbundel in, lijnt u het monster uit en stelt u de focus in met een hoge vergroting (verblijftijd van 0,8 μs). Voer eerst de eerste beoordeling uit met het hele raster in beeld bij lage vergroting (x45). Neem een afbeelding op bij deze vergroting. Verhoog de vergroting om nadere inspectie van individuele rastervierkanten mogelijk te maken, individuele kristallen moeten zeer duidelijk waarneembaar zijn. Beweeg over het raster en leg stilstaande beelden (verblijftijd van 16 μs) van kristallen vast en zorg ervoor dat ze aan de volgende vereisten voldoen voordat u doorgaat: Zorg ervoor dat roosters vlak zijn en dat de koolstofdragerfilm grotendeels intact is. Zorg ervoor dat er talloze enkelvoudige kristallen zijn met een smalle halo van verglaasde vloeistof rond het kristal. Zorg ervoor dat de gaten in de carbon draagfilm zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat er geen grote gebieden verglaasde vloeistof zijn zoals gedefinieerd door een donker en glad uiterlijk. Zorg ervoor dat er weinig of geen zeshoekig ijs of oppervlakte-ijs over het raster is verspreid. Zorg ervoor dat de kristallen gelijkmatig over de steunfolie worden verdeeld en elkaar niet overlappen. Meet op dit punt nauwkeurig de afmetingen van een aantal kristallen om een nauwkeurige correlatie van de grootte van röntgenstralen mogelijk te maken tijdens latere diffractie-experimenten. Monsters die betrouwbaar uit de SEM kunnen worden gehaald en bij cryogene temperaturen kunnen worden gehouden, kunnen later worden gebruikt voor röntgendiffractie-experimenten. Als dit niet mogelijk is, gooi deze monsters dan weg.OPMERKING: Bij het in beeld brengen van zowel het hele raster als de afzonderlijke microkristallen (respectievelijk ongeveer x45 en x700 vergroting), moet worden beoordeeld of moet worden overgegaan tot de bundellijn met rasters die zijn voorbereid met behulp van dezelfde parameters of dat sommige parameters mogelijk moeten worden aangepast tijdens stap 3. De roosters moeten voldoen aan de in stap 5.5 beschreven tests. Als de rasters niet aan deze criteria voldoen, is verdere optimalisatie tijdens stap 3 vereist voordat stap 5 wordt herhaald. 6. Rooster voorbereiden voor diffractie-experimenten bij VMXm Koel het vereiste aantal VMXm-monsterhouders(figuur 4A)(maximaal 5) geladen in de monstercartridge (met deksel) met de monsterlader in een groot schuimdewar (figuur 4B) met behulp van vloeibare stikstof – dit kan een groot volume vloeibare stikstof vereisen. Het niveau van vloeibare stikstof moet net boven de monsterpositie op de monsterlader liggen. Bereid circlips en gereedschappen voor. Plaats gereedschappen zoals knipgereedschap, tangen en VMXm-monsterkraps in gaten in de monsterlader om af te koelen. Het kan handig zijn om een spot boven de dewar te plaatsen. Breng de rasterdoos met de met microkristal beladen roosters snel over naar de uitsparing van de rasterdoos op de monsterlader en schroef het deksel zodanig los en draaibaar los (niet verwijderen). Verwijder onder vloeibare stikstof het deksel van de monsterpatroon met een grote tang en plaats deze onder de monsterlader. Gebruik de VMXm-monsterkrap om de monsterhouder op de monsterlader te tillen en ervoor te zorgen dat de houder naar boven is gericht, zodat deze een rooster kan accepteren. Wanneer u zich in de juiste positie bevindt, zal een kleine pin op de monsterlader het kleine gat in het midden van de monsterhouder raken. Til met de afgekoelde fijne tang het rooster voorzichtig uit de roosterbox en breng dicht bij de roosteropening op de monsterhouder over. Draai het raster zo dat het plat ligt (het maakt niet uit op welke kant de steunfoliezijde gericht is). Laat de tang voorzichtig zakken zodat het rooster zo dicht mogelijk boven de roosteropening ligt (pas op dat u het rooster niet buigt) en laat het rooster los in de opening. Als het rooster niet goed zit, gebruik dan voorzichtig de fijne tang om het rooster in positie te duwen of tik voorzichtig op de monsterhouder met de grotere tang. Plaats het voorgekoelde circlipgereedschap snel over het rooster in de roosteropening en plaats de circlip door op de knop te drukken. Het kan handig zijn om 2 indrukken van de knop aan te brengen om ervoor te zorgen dat de circlip goed zit. Pas de vloeibare stikstof aan zodat het niveau ~ 1,5 cm boven de monsterhouder ligt. Til met behulp van de VMXm-monsterkrap de geladen monsterhouder voorzichtig op en over de kleine pin op de monsterlader en terug in de monstercartridge. Noteer het positienummer van de monsterhouder in de monstercartridge. Blijf roosters in de monsterhouders laden totdat alle monsters zijn geladen. Breng de rastervakken terug naar de opslag dewar als er monsters in blijven en verwijder de monsterlader uit de dewar om meer ruimte te creëren. Plaats het deksel van de cartridge terug en zorg ervoor dat de pin aan de bovenkant van de cartridge het gat in het deksel raakt. Koel en vul de VMXm luchtsluis dewar met vloeibare stikstof en plaats naast het schuim dewar met de geladen monstercartridge. Gebruik het VMXm-cartridgegereedschap voorzichtig in de ribbels aan de zijkant van de cartridge en til de cartridge snel in de luchtsluis dewar. Zorg ervoor dat het vloeibare stikstofgehalte de patroon bedekt. Plaats het deksel op de luchtsluis dewar en ga met de geladen monstercartridge naar het VMXm-eindstation.OPMERKING: Het laden van de monstercartridge in het VMXm-eindstation wordt uitgevoerd door beamline-personeel.

Representative Results

Het doel van dit protocol is om verglaasde microkristallen te bereiken met een minimaal volume vloeistof rond het kristal die röntgendiffractie-experimenten met minimale achtergrondverstrooiing mogelijk maken om het diffractiesignaal te verbeteren. Voorbeeld SEM-beelden van microkristallen die zijn geprepareerd op cryoTEM-rasters voor minimale achtergrondverstrooiing worden weergegeven in figuur 1A, B en figuur 2. Rasters met gelijkmatig verdeelde enkelvoudige kristallen zorgen voor het meest efficiënte gebruik van het net, met goede signaal-naar-ruis. Dit is echter meestal niet mogelijk over het hele raster en sommige regio’s kunnen een zekere mate van klonteren vertonen (Figuur 2A, B). Ondanks deze klonter tonen deze voorbeelden nog steeds een nuttig aantal afzonderlijke geïsoleerde kristallen die een lage achtergronddiffractie zullen bieden(figuur 5). Het niveau van de vlekken dat nog steeds een lage achtergrondverstrooiing handhaaft, kan variëren. Sterk vlekken zodat de gaten in de koolstofondersteunende film duidelijk zichtbaar zijn, maar de kristallen gehydrateerd blijven, is het doel(figuur 2C, D). Rasters van goede kwaliteit kunnen echter nog steeds wat vloeistof in de gaten van de steunfilm weergeven, hoewel de positie van de gaten nog steeds identificeerbaar moet zijn(figuur 2A, B). Belangrijk is dat al deze voorbeelden enkele, geïsoleerde kristallen vertonen met een verglaasde halo van vloeistof rond het kristal om de hydratatie te behouden tussen het depen en het bevriezen. Veel monsters kunnen verdere optimalisatie vereisen(figuur 3),waaronder variatie van de blottingtijd of de concentratie van de microkristallen. Rasters die overladen zijn met kristallen zullen een verminderde vloeiefficiëntie vertonen en kunnen ertoe leiden dat meerdere roosters worden vastgelegd in enkele diffractiebeelden(figuur 3A, B). Meer viskeuze kristallisatieomstandigheden, zoals die voor trypsine dat 8% PEG 4000 en 15% ethyleenglycol bevat(figuur 3C),kunnen resulteren in de noodzaak van langere deptijden (>10 s). Omgekeerd kunnen kristallisatieomstandigheden met een zeer lage viscositeit die zeer snel deinen, last hebben van distributieproblemen als gevolg van de zwaartekracht die bezinking veroorzaakt voordat blotting optreedt, wat resulteert in alle microkristallen die langs één kant van het raster bezinken (Figuur 3D). Optimale voorbereiding van monsters maakt het mogelijk om de volledige mogelijkheden van VMXm te benutten om hoogwaardige röntgendiffractiegegevens te verzamelen met de hoogst mogelijke resolutie met een hoog signaal-ruis(figuur 5). Deze monsters profiteren van het feit dat ze compatibel zijn met de in-vacuo-steekproefomgeving, wat resulteert in zeer lage of nul gemiddelde achtergrondtellingen in diffractiebeelden. Het gebruik van vloeibaar ethaan, zonder cryo-protectant, resulteert in een afwezigheid van ijsringen (figuur 5), hoewel waar kristallen dicht bij de koperen rasterstaven liggen, de röntgenstraal de staven kan bekijken, wat resulteert in koperpoederdiffractieringen op ~ 2,1 Å en ~ 1,8 Å. Figuur 1: Vergelijking van microkristalmontage op micromesh-steunen en cyoTEM-roosters. Scanning elektronenmicrofoto’s van ingevroren microkristallen van viruspolyhedraal meten 2,5 μm over (A, B) 5 kV versnellende spanning, een spotgrootte van 39 (willekeurige eenheden) en verblijftijd van 16 μs. Het rooster is vrij van overtollige vloeistof (A), een smalle halo van vloeistof wordt waargenomen rond de kristallen (B). Dezelfde monsters gemonteerd op een micromesh (20 μm openingen) vóór flitskoeling in vloeibare stikstof en waargenomen met behulp van het on-axis-viewing-systeem op beamline I24 face-on (C) en side on (D). De optische vervormingen (C) bij het bekijken van face-on geven een indicatie van de omvang van de vloeistofdikte over de micromesh, dit is duidelijker bij het bekijken van de micromesh side-on (D). Het rode doel in C en D vertegenwoordigt de positie en grootte van de röntgenstraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Voorbeelden van monsters van goede kwaliteit. Veelvlakken kristallen (A) waargenomen over een enkel raster van ~ 100 μm vierkant. Hoewel sommige van de kristallen enigszins samengeklontert zijn en enige connectiviteit van de omringende vloeistof vertonen, zijn er een aantal geïsoleerde enkele kristallen met een kleine halo van vloeistof rond het kristal. Iets grotere insulinekristallen(B)van ~5 x 5 μm vertonen ook wat klonteren maar ook hier zijn er goed geïsoleerde individuele kristallen. Naaldkristallen kunnen een zeer smalle dimensie hebben en vereisen een microbeam, zoals deze naaldvormige lysozymkristallen(C). Rond deze kristallen is een smalle band van vloeistof te zien (lichtgrijze halo). Grotere microkristallen tot tientallen microns kunnen ook goed worden gemonteerd op cryoTEM-roosters, zoals deze ~ 7 μm proteïnase K-kristallen(D). Zowel in (C) alsinmindere mate in (A) zijn de gaten van de koolstofdragerfilm duidelijk zichtbaar, wat de aanwezigheid van zeer weinig / geen vloeistof aantoont. In voorbeeld B, hoewel er geen lege gaten worden waargenomen, kan de positie van de gaten nog steeds worden geïdentificeerd, wat aangeeft dat de vloeistof alleen de gaten in de ondersteuningsfilm vult. In al deze voorbeelden is een halo van vloeistof te zien rond de rand van het rastervierkant (een afgerond binnenste vierkant), waar de gaten een lichter grijs uiterlijk hebben. Dit is een gemeenschappelijk kenmerk van goed voorbereide roosters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Voorbeelden van monsters die verder moeten worden geoptimaliseerd. Roosters overbelast met microkristallen (A, B) kunnen de achtergrondverstrooiing vergroten naarmate de monsters de gaten in de ondersteuningsfilm blokkeren, waardoor de vloeiefficiëntie wordt verminderd en met een hogere oppervlaktespanning tussen de kristallen meer vloeistof achterblijft. Naast een verslechtering van de signaal-naar-ruis die resulteert in een verlies van informatie, is het waarschijnlijk dat meerdere roosters zullen worden geregistreerd. Het gebruik van een blottingtijd die niet lang genoeg is, of een zeer viskeuze kristallisatieoplossing kan resulteren in een te nat monster(C),dat ook weinig signaal-ruis produceert. Kristallisatieomstandigheden zonder precipitanten, zoals die voor runderinsuline (D), hebben een zeer lage viscositeit. Hoewel dit resulteert in een zeer korte deiningstijd, kan het ook resulteren in de beweging van kristallen over het raster voor en tijdens het depen als gevolg van de effecten van de zwaartekracht. Dit resulteert meestal in een grotendeels leeg raster met een hoge concentratie kristallen langs één rand(D). Het kan voordelig zijn om een viskeus middel zoals ethyleenglycol aan de kristalbrij toe te voegen kort voordat u ze op het rooster aanbrengt om de kristalstroom te verminderen en de verdeling van de kristallen te verbeteren. Dit kan ook de vloeitijd verlengen, waardoor het gemakkelijker wordt om vloeien waar te nemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Gereedschappen voor het laden van monsters bij VMXm. Een op maat gemaakte set gereedschappen is ontworpen om de VMXm-monsterhouders (A) te laden. De monsterlader (B) heeft ruimte voor een enkele VMXm-monsterhouder, rasterdoos en gereedschapsopslag tijdens het werken. Het is ook ontworpen om net onder het oppervlak van de vloeibare stikstof te kunnen werken en de monsterpatroon onder (B) te laten passen. De airlock dewar (C), die past op de luchtsluis stikstofgasdoos op het VMXm-eindstation, wordt gebruikt om de geladen monstercartridge van het laboratorium naar het beamline experimentele hok te brengen. Om monsters in de offline SEM te bekijken, is een op maat gemaakte shuttle(D)gemaakt bestaande uit de VMXm-monsterhouder zonder basis om beoordeling mogelijk te maken in de monsterhouder die op de beamline wordt gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Voorbeelddiffractie van microkristallen bij VMXm. Een enkel diffractiebeeld opgenomen met behulp van een Pilatus 3 6M-detector bij VMXm van een ~ 3 μm viruspolyhedraal kristal gemonteerd op een cryoTEM-raster met behulp van de plunge freezing-methode. Diffractie wordt waargenomen tot voorbij 1,7 Å en een reflectie (blauw vierkant) bij 1,74 Å wordt ingelegd, wat de lage achtergrondverstrooiing aantoont, met een hoog aantal pixels met nultellingen. Ethyleenglycol tot een eindconcentratie van 50% v/v werd toegevoegd aan de kristalbrij voordat het op het rooster werd aangebracht. Het lage achtergrondkarakter van de VMXm-monsterpositie wordt aangetoond door de constante achtergrond over het beeld, zoals blijkt uit intensiteiten die onder de blauwe stippellijn zijn uitgezet, zelfs in de buurt van het straalcentrum. De uitgezette intensiteiten laten zien dat de achtergrond onder de 3 tellingen blijft. Bij 2,15 Å en 1,86 Å worden twee zwakke ringen waargenomen die worden gegenereerd door poederdiffractie van het koper van het cryoTEM-raster. Er zijn geen detecteerbare ijsringen, wat de effectiviteit van vloeien aantoont, gevolgd door koeling met vloeibaar ethaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol laat zien hoe hulpmiddelen van cryoTEM-monstervoorbereiding kunnen worden gebruikt voor de voorbereiding van microkristallen voor röntgendiffractie-experimenten op microfocus-bundellijnen. Standaard beamline-instrumentatie is gecentreerd rond een op een pin gemonteerd monster en hoewel er inspanningen zijn geleverd om een monsterondersteuning te bieden op deze steunen voor microkristallen, zijn ze vaak een uitdaging om met monster te laden terwijl ze ervoor zorgen dat het hoogste signaal-ruis wordt bereikt(Figuur 1C, D). Veel van deze monsters kunnen ook optimalisatie van de cryo-beschermingsomstandigheden vereisen om ervoor te zorgen dat het monster glasachtig is. De dompelbevriezingsmethode biedt een herhaalbare manier om overtollige vloeistof te verwijderen en het monster te koelen in een efficiënt cryogeen (figuur 1A, B). Hoewel het rooster vervolgens kan worden gemonteerd op een standaard beamline met een pinbevestiging op basis van een pincet, zijn VMXm-monsterhouders speciaal ontworpen om roosters te accepteren en ze onder de glasovergangstemperatuur in een vacuümomgeving te houden via geleidende koeling. De monsteromgeving van VMXm maakt het verzamelen van gegevens met een lage achtergrond mogelijk, waarbij het monster de resterende bron van achtergrond is, en biedt een microbeam dat kan worden gebruikt om kristallen met afmetingen van minder dan 10 μm te matchen. Deze monstervoorbereidingsmethode kan ook worden gebruikt om nanokristallen te bereiden op elektronendiffractie waarbij er ook zeer weinig overtollige vloeistof en een glasvochtmonster nodig is vanwege de zwakke penetratie van elektronen. Hoewel cryoTEM-roosters kwetsbaar zijn, zullen degenen die ervaring hebben met het oogsten van kristallen in lussen zich snel aanpassen aan de behandeling van de roosters. Met een kleine hoeveelheid ervaring zullen er weinig roosters verloren gaan tijdens de vloei-, vries- en laadfasen van het protocol. De optimalisatiestappen zijn echter van cruciaal belang voor dit succes en een zorgvuldige voorbereiding zal de kans op het verliezen van kristallen of het verminderen van de kristalintegriteit verminderen.

CryoTEM-rasters bieden een relatief grote enkele vatting die vele honderden kristallen kan bevatten, waardoor de doorvoer wordt verbeterd waar het mogelijk is om slechts een kleine wig aan diffractiegegevens vast te leggen. Een enkel raster kan ook voldoende kristallen leveren om de eiwitstructuur te bepalen, met name in kristallen met een hoge symmetrie. Waar slechts één of twee enkele kristallisatiedruppels microkristallen hebben gegenereerd, kan proefdepen van de kristallisatieconditie alleen helpen ervoor te zorgen dat wanneer de microkristallen worden uitgeveegd, de gebruikte tijden zo dicht mogelijk bij die liggen die nodig zijn om initiële monsters van goede kwaliteit te genereren. De koolstoffilmsteunen zijn onzichtbaar voor röntgenstralen en zijn verkrijgbaar met verschillende gatafstanden, die kunnen worden gebruikt om aan een bepaalde morfologie te voldoen. We gebruiken meestal ondersteuningsfilms met gaten van 2 μm op een afstand van 2 μm, maar kleinere gaten met een grotere afstand kunnen geschikter zijn voor kristallen kleiner dan 2 μm. Andere ondersteuningsfilms zoals die met gaten van 1 μm met een afstand van 4 μm en ondersteuningsfilms met verschillend gevormde gaten zijn beschikbaar, die allemaal van invloed zijn op de devlotingstijd. Een raster vierkante maaswijdte van 200 (200 vierkanten per inch) biedt ook voldoende ruimte (~ 100 μm) tussen de koperen rasterstaven, zodat de röntgenstraal niet sterk interageert met het koper en voldoende structurele ondersteuning biedt voor de koolstoffilm geladen met kristallen. Het gebruik van vloeibaar ethaan ontkent de behoefte aan cryoprotectanten, wat op zijn beurt de behoefte aan monstervolume vermindert die zou zijn gebruikt bij de optimalisatie van cryoprotectante omstandigheden.

De belangrijkste parameters die tijdens het proces moeten worden geoptimaliseerd, zijn de blottingtijden en de monsterverdunning. De vloeitijden moeten lang genoeg zijn om het ‘knallende’ effect over het hele raster te observeren voordat het bevriest. Overbevochtiging kan leiden tot uitdroging van de kristallen, maar controle van de vochtigheid in de monsterkamer wordt gebruikt om dit effect te minimaliseren. Hoewel wordt gesuggereerd dat een relatieve vochtigheid van 90% wordt gebruikt, kunnen sommige monsters baat hebben bij het optimaliseren van de luchtvochtigheid. De vochtigheid kan van invloed zijn op de vloeiefficiëntie van het vloeipapier dat langzaam verzadigd kan raken met water. Bovendien kan de vochtigheidsregeling in de monsterkamer worden gebruikt om de diffractiekwaliteit van de kristallen te verbeteren30. Het wordt aanbevolen om kleine veranderingen (<5%) in de luchtvochtigheid aan te brengen voordat de diffractie-integriteit wordt gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de diffractiekwaliteit niet wordt aangetast.

Optimalisatie van niet-kostbare monsters kan worden uitgevoerd met behulp van een lichtmicroscoop in plaats van een SEM. Hoewel het destructief is, is het nuttig voor het beoordelen van de dichtheid van kristallen over het raster en om besluitvorming mogelijk te maken over de vraag of een monster moet worden verdund of geconcentreerd om kristallen beter over het raster te verspreiden. Deze stap is het handigst wanneer er een groot aantal kristallen beschikbaar is en bijzonder sterk geconcentreerde monsters. Samenklonteren van kristallen moet worden vermeden (figuur 3), want hoewel het geen significant probleem is als twee kristallen tegelijkertijd worden verlicht tijdens het verzamelen van gegevens6, zal er waarschijnlijk een groter volume vloeistof rond de klomp zijn, waardoor het signaal-naar-ruis wordt verminderd (Figuur 5). Hoewel het mogelijk is om grote overschotten van vloeistof wereldwijd over het raster te observeren met behulp van een lichtmicroscoop, kan de beoordeling van het vloeistofvolume rond de microkristallen en de aanwezigheid van kristallijn ijs alleen worden gemaakt met behulp van een elektronenmicroscoop die is uitgerust met een cryogeen vacuümoverdrachtssysteem en -stadium. Soms, na het aanbrengen van de kristallen op het rooster en voordat er vloeiing optreedt, kunnen kristallen in oplossingen met een lage viscositeit langs één rand van het rooster bezinken. We hebben ontdekt dat het optellen tot een eindconcentratie van 50% ethyleenglycol de beweging van kristallen door de druppel kan vertragen, wat zorgt voor een betere verdeling van microkristallen over het net en meer controle biedt over het depen door de deegtijd te verhogen(Figuur 3D).

Sommige kristallisatieoplossingen die viskeuze precipiterende middelen bevatten, zoals PEG’s met een hoog molecuulgewicht, kunnen een uitdaging zijn om te depen, waardoor steeds lange blottingtijden (>10 s) nodig zijn. In dergelijke gevallen kan het nuttig zijn om het volume vloeistof dat op de achterkant van het rooster wordt afgezet, evenals het volume van de kristalhoudende oplossing aan de ondersteuningsfilmzijde van het raster te verminderen. Strategieën zoals het gebruik van 2 lagen vloeipapier of glasvezels kunnen ook helpen bij het depen in deze moeilijke gevallen31.

Hoewel deze pijplijn geschikt is voor oplosbare eiwitkristallen, vormen die welke zich vormen in zeer viskeuze media zoals membraaneiwitten in LCP een andere uitdaging waarvoor dit protocol niet geschikt is. Er ontstaan echter strategieën voor het voorbereiden van LCP-kristallen op cryoTEM-rasters voor microED, waaronder het verminderen van de viscositeit van de monsters door een faseverandering in de LCP te induceren. Hierdoor kunnen de monsters op een vergelijkbare manier op rasters worden aangebracht als in dit artikel wordt beschreven. Ten slotte kan het monster worden gefreesd met een gerichte ionenbundel om overtollig niet-kristalmateriaal32,33,34te verwijderen.

Over het algemeen duurt het over het algemeen 1-2 uur (inclusief de installatietijd van de apparatuur) voordat het monster bij VMXm aankomt, wordt gevolgd tot het leveren van geoptimaliseerde roosters met goed verspreide, verglaasde monsters, afhankelijk van de beschikbaarheid van het monster, de concentratie van kristallen en de viscositeit van de kristallisatieoplossing. Deze methoden zijn al met succes gebruikt voor de voorbereiding van microkristallen voor röntgendiffractie-experimenten waarbij stralingsschade op microkristallen werd onderzocht waar een minimaal volume vloeistof rond het monster essentieel was28,35. Opgemerkt moet worden dat het protocol kan worden toegepast op alle oplosbare microkristalmonsters, niet alleen op goed diffracterende monsters die al zijn geoptimaliseerd. Een kristallisatie-experiment dat microkristallijn materiaal produceert, zou traditioneel een doelwit zijn voor optimalisatie met als doel grotere kristallen te verkrijgen, maar deze monstervoorbereidingsmethode en de mogelijkheden van VMXm kunnen het mogelijk maken om voldoende gegevens van dergelijke monsters te verzamelen zonder verdere optimalisatie. Als alternatief, als dergelijke microkristallijne monsters slecht diffracten, kunnen de gegevens die zijn verzameld van VMXm met behulp van deze monstervoorbereidingsmethode nog steeds fungeren als een nuttige gids voor verdere optimalisatie van kristallisatieomstandigheden. De hulpmiddelen voor het voorbereiden van roosters, waaronder gloeien en invriezen, zijn nu op grote schaal beschikbaar in onderzoeksinstituten die zijn uitgerust voor cryoTEM-experimenten en zullen beschikbaar zijn voor veel gebruikers, zodat ze monsters kunnen voorbereiden voorafgaand aan de beamtime bij VMXm.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton en Dave Stuart, STRUBI University of Oxford en Rachel Bolton, University of Southampton bedanken voor het vriendelijk leveren van microkristalmonsters voor de ontwikkeling en demonstratie van monstervoorbereidingsmethoden voor de VMXm-beamline, naast het mogelijk maken van de inbedrijfstelling van de beamline. De auteurs willen ook iNEXT-Discovery (projectnummer 871037) bedanken voor de mogelijkheid en ondersteuning bij het publiceren van dit manuscript.

Materials

Automated Cryo-EM plunge freezing instrument Leica or ThermoFisher Various
Benchtop light microscope with light source Various Various
Blade/Scalpel Fisher Scientific Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes Quantifoil N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes Agar Scientific AGG3727
ddH2O n/a n/a
Ethane gas supply n/a n/a
Ethylene Glycol Acros Organics 146750010
Glass microscope slides FisherBrand 12383118
Glass petri dish FisherBrand 455732
Glow discharging device Pelco 91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm) Bemis HS234526B
Large and small, fine forceps Agar Scientific Various
Liquid nitrogen supply n/a n/a
Pipette tips Various Various
Pipetting devices Various Various
Sealing tape for crystallisation plates. Molecular Dimensions MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars Spearlab Various
Sprung circlip clipping tool Subangstrom SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper Leica 16706440
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).
  15. . MiTeGen Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020)
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

Tags

AI-assisted Sample PreparationMicrocrystal HandlingCryoTEM Grid PreparationPlunge FreezingBackground ReductionX-ray DiffractionSample BlottingCrystallization Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Crawshaw, A. D., Beale, E. V., Warren, A. J., Stallwood, A., Duller, G., Trincao, J., Evans, G. A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline. J. Vis. Exp. (172), e62306, doi:10.3791/62306 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image