Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Las proteínas implicadas en el tráfico de metabolitos constituyen un nivel esencial de regulación fisiológica, pero la gran mayoría de los transportadores de membranas vegetales aún no se han caracterizado funcionalmente. Se han implementado varias estrategias para caracterizar las nuevas proteínas de transporte. La expresión hetróloga en organismos modelo como E. coli y células eucariotas como levaduras, ovocitos de Xenopus, células de mamíferos, células de insectos y células vegetales se han utilizado para determinar su actividad de transporte¹. Las células eucariotas son favorecidas por la expresión de proteínas eucariotas, ya que la composición celular básica, las vías de transducción de señales, la transcripción y las máquinas de traducción son compatibles con las condiciones nativas.

La levadura ha sido un organismo modelo importante para la caracterización de nuevas proteínas de transporte en las plantas. La primera proteína de transporte vegetal que se expresó con éxito en levadura (Saccharomyces pombe) fue el transportador de hexosa HUP1 de Chlorella². Desde entonces, muchas proteínas de transporte de plantas se han caracterizado funcionalmente utilizando un sistema de expresión de levadura. Estos incluyen, los transportadores de azúcar vegetal (SUC1 y SUC2³, VfSUT1 y VfSTP1⁴) y los transportadores de auxin (AUX1 y PIN^5). Las desventajas de utilizar levadura para expresar proteínas vegetales pueden incluir deterioro de la actividad de las proteínas localizadas por plastid porque la levadura carece de este orgánulo, el objetivo erróneo⁶, y la formación de agregados mal plegados y la activación de respuestas de estrés en la levadura debido a la sobreexpresión de proteínas de membrana^7,8,9.

La expresión heteróloga de proteínas de transporte en los ovocitos Xenopus ha sido ampliamente utilizada para la caracterización electrofisiológica de los transportadores¹⁰. Las primeras proteínas de transporte vegetal caracterizadas por expresión hetróloga en los ovocitos de Xenopus fueron el canal de potasio Arabidopsis KAT1¹⁰ y el transportador de hexosa Deabidopsis STP1^11. Desde entonces, los ovocitos de Xenopus se han empleado para caracterizar muchas proteínas de transporte vegetal como los transportadores de membrana plasmática¹², transportador de sacarosa vacuola raquídor SUT4¹³ y transportador de malatovacuo ALMT9¹⁴. Una limitación importante de los ovocitos de Xenopus para los ensayos de transporte es que la concentración de metabolitos intracelulares no puede ser manipulada¹. Además, se requieren conocimientos profesionales para preparar los ovocitos de Xenopus y la variabilidad de los lotes de ovocitos es difícil de controlar.

La expresión heteróloga en el organismo modelo E. coli es un sistema ideal en términos de caracterización de nuevas proteínas de transporte vegetal. Con un genoma¹⁵completamente secuenciado, las características moleculares y fisiológicas de E. coli son bien conocidas. Las herramientas y técnicas moleculares están bien establecidas^16. Además, diferentes vectores de expresión, cepas no patógenas y mutantes están disponibles^17,18,19. Además, E. coli tiene una alta tasa de crecimiento y se puede cultivar fácilmente en condiciones de laboratorio. Muchas proteínas se pueden expresar y purificar fácilmente en grandes cantidades en E. coli⁹. Cuando las proteínas no se pueden ensayo directamente en los sistemas celulares, la reconstitución de proteínas en liposomas también ha sido una innovación exitosa, aunque desafiante para la caracterización de proteínas de membrana purificadas. La caracterización funcional de las proteínas de transporte mitocondrial vegetal, incluidos los transportadores de solutos como los transportadores de fosfato en soja, maíz, arroz y Arabidopsis, portadorde de dicarboxilato-tricarboxilato en Arabidopsis, se han logrado utilizando este sistema modelo^20,21. Sin embargo, se encontró que las proteínas recombinantes de la proteína de tomate SICAT9 no eran funcionales en experimentos de reconstitución, y se encontró que otros miembros de la familia de transportadores CAT no eran funcionales en los ensayos de ovocitos del xenopus ^22. Por lo tanto, se necesitan herramientas moleculares adicionales para la caracterización de los transportadores de membranas.

Cinco sistemas de transporte de poliamina se encuentran en E. coli²³. Incluyen dos transportadores ABC que median la toma de espermidina y putrescina, un intercambiador de putrescina/ornitina, un intercambiador de cadaverina/lisina, un exportador de espermadina y un importador de putrescina. El intercambiador de putrescina PotE se caracterizó originalmente utilizando un ensayo de vesícula, donde de adentro hacia afuera se preparaban vesículas cortando células con una prensa francesa y midiendo la toma de putrescina radioetiquetada en las vesículas a cambio de ornitina^24. Los ensayos de vesículas también se utilizaron para caracterizar a un transportador de calcio, que mediaba en el transporte de calcio en respuesta a un gradiente de protones^25. Estos experimentos nos llevaron a desarrollar una estrategia para la caracterización de otros intercambiadores de poliamina. Primero creamos una cepa de E. coli deficiente en intercambiadores PotE y CadB. Aquí, demostramos la caracterización funcional de una planta antiportadora de poliamina por expresión heterlomea en la cepa modificada de E. coli, generación de vesículas de membrana utilizando una prensa francesa y ensayos radiomarcados.