אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

חלבונים המעורבים בסחר של מטבוליטים מהווים רמה חיונית של רגולציה פיזיולוגית, אבל הרוב המכריע של מובילי הצמח ממברנה עדיין לא התאפיין מבחינה פונקציונלית. מספר אסטרטגיות יושמו על מנת לאפיין את החלבונים בתחבורה הרומן. הטרוולוגי ביטוי אורגניזמים כגון E. coli ו איקריוטית תאים כגון שמרים, xenopus oocytes, תאים מהיונקים, תאים חרקים ותאי הצמח כל שימשו כדי לקבוע את פעילות התחבורה שלהם¹. תאים איקריוטית הם המועדף על הביטוי של חלבונים איקריוטית, כי הרכב הסלולר הבסיסי, העברת אותות מסלולים, תמלול ותרגום machineries תואמים את התנאים המקומיים.

שמרים כבר אורגניזם מודל חשוב לאפיון של חלבונים התחבורה הרומן בצמחים. הצמח הראשון של התחבורה חלבון אשר התבטא בהצלחה ב שמרים (סכמיקו פומבה) היה המוביל ההקז HUP1 מ כלורלה². מאז, הרבה העברת צמחים חלבונים האופיינים פונקציונלית באמצעות מערכת ביטוי שמרים. אלה כוללים, הצמח מובילי סוכר (SUC1 ו SUC2³, VfSUT1 ו VfSTP1⁴) ואת מובילי האוקאין (AUX1 ו-PIN⁵). החסרונות של ניצול שמרים כדי לבטא חלבונים צמחיים יכולים לכלול פעילות לקויה של חלבונים מקומי פלסטיות מכיוון שמרים חסר זה אורגנל, mistargeting⁶, והיווצרות של אגרגטים מקופלים והפעלה של תגובות המתח שמרים בשל הבעות יתר של חלבונים ממברנה^7,8,9.

ביטוי הטרוולוגי של חלבונים בתחבורה בקסנפוס אוציטים שימשו רבות לאפיון האלקטרולוגי של מובילי¹⁰. המפעל הראשון של הרכב חלבונים המאופיינת באמצעות ביטוי הטרוולוגי ב Xenopus oocytes היו ערוץ האשלגן KAT1¹⁰ ו-arabidopsis טרנספורטר הקסז STP1¹¹. מאז, xenopus oocytes המועסקים כדי לאפיין רבים הובלה צמחים חלבונים כגון מובילי קרום פלזמה¹², וולאר סוכרוז SUT4¹³ ו המשלח מאלער ארמיטה ALMT9¹⁴. מגבלה חשובה של Xenopus oocytes עבור התחבורה אומר הוא כי הריכוז של מטבוליטים תאיים לא יכול להיות מניפולציות¹. יתר על כן, הידע המקצועי נדרש כדי להכין Xenopus oocytes והשונות של אצוות oocyte קשה לשלוט.

ביטוי הטרוולוגי באורגניזם מודל E. coli היא מערכת אידיאלית במונחים של אפיון של הרכב הרומן הייצור חלבונים. עם הגנום הרציף¹⁵, המאפיינים המולקולריים והפיזיולוגיים של E. coli ידועים היטב. כלים מולקולריים וטכניקות מבוססים היטב¹⁶. בנוסף, וקטורים ביטויים שונים, זנים שאינם פתוגניים ומוטציות זמינים^17,18,19. יתר על כן, E. coli יש שיעור צמיחה גבוהה והוא יכול להיות בקלות גדל בתנאי מעבדה. חלבונים רבים ניתן להתבטא בקלות ומטוהרים בכמויות גבוהות E. coli⁹. כאשר חלבונים לא יכולים להיות ישירות במערכות הסלולר, החוקה של חלבונים לתוך ליפוזומים גם היה מוצלח, אם כי מאתגר חדשנות לאפיון של חלבונים קרום מטוהרים. אפיון פונקציונלי של הובלה מיטוכונדריאלי של הצמח חלבונים כולל מובילי מסיסות כגון מובילי פוספט סויה, תירס, אורז, arabidopsis, dicarboxylate אוחר-tricarboxylate המוביל ב arabidopsis הושגה באמצעות מערכת זו מודל^20,21. עם זאת, רקומביננטי חלבונים של חלבון העגבניות SICAT9 נמצאו לא פונקציונלי בניסויים מחדש, וחברים אחרים של משפחת טרנספורטר החתול נמצאו לא פונקציונלי ב xenopus oocyte בחני²². לכן, יש צורך בכלים מולקולריים נוספים לאפיון מובילי הקרום.

חמש מערכות תחבורה פוליאמין. נמצאו ב -אי קולי²³ הם כוללים שני מובילי ABC מדיה ספיגה של spermidine וריקבון, מחליף ריקבון/הצפרים, מחליף cadaverine/ליזין, היצואן spermidine ומייבא ריקבון. הריקבון מחליף PotE היה מאופיין באמצעות שלפוחית הזרע, שם הפנים החוצה הוכנו על ידי לישיתאים עם העיתונות הצרפתית ומדידת ספיגה של הריקבון לתוך השלפוחיות בתמורה הצפרים²⁴. ושלפוחית מספרת שימשו גם כדי לאפיין מוביל סידן, אשר מתווך את ההובלה של סידן בתגובה למעבר פרוטון²⁵. ניסויים אלה התבקשו מאיתנו לפתח אסטרטגיה לאפיון של מחליפי פוליאמין אחרים. בתחילה יצרנו זן של אי קולי חסר. בחומר מחליפי החומר כאן, אנו מדגימים את האפיון התפקודי של צמח פוליאמין antiporter על ידי הביטוי הטרוולוגי במתח שהשתנה E. coli , הדור של שלפוחיות קרום באמצעות העיתונות הצרפתית, וקרינה assays.