大肠杆菌中异构表达对膜迁移者的特性与膜囊泡的产生

参与代谢物贩运的蛋白质构成生理调节的基本水平，但绝大多数植物膜转运者尚未具有功能特征。已经实施了几种策略来描述新的运输蛋白。大肠杆菌和真核细胞（如酵母、异体卵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞）中的异体表达都被用来确定其迁移活性^1。真核细胞是真核蛋白表达的宠儿，因为基本的细胞组成、信号转导途径、转录和翻译机与原生条件兼容。

酵母是植物中新型运输蛋白表征的重要模型。第一个植物运输蛋白，成功地表达在酵母（糖霉菌）是六氯苯（HUP1）从小球藻^2。自那时以来，许多植物运输蛋白一直使用酵母表达系统进行功能特征化。其中包括植物糖运输机（SUC1和SUC2 3、VfSUT1和VfSTP1^4）和辅助糖运输机（AUX1和^PIN5）。利用酵母表达植物蛋白的缺点包括，由于酵母缺乏这种细胞器，而蛋白原体局部蛋白的活性受损，靶向错误^，以及由于膜蛋白^7、8、9的过度表达而在酵母中形成错误折叠的聚集体和激活应激反应。

异体表达在异体细胞中的运输蛋白已被广泛用于运输器¹⁰的电生理表征。第一个植物运输蛋白，在Xenopus卵母细胞中使用异体表达为特征的是阿拉伯拟钾通道KAT1¹⁰和阿拉伯拟南芥六角体运输机STP1^11。自那时以来，Xenopus卵母细胞已被应用于许多植物运输蛋白的特征，如血浆膜运输器^12，真空蔗糖运输器SUT4¹³和真空麻黄素运输机ALMT9^14。转移性卵母细胞用于运输测定的一个重要限制是细胞内代谢物的浓度不能纵^{1 。}此外，需要专业知识来准备Xenopus卵母细胞，并且卵母细胞批次的变异性难以控制。

模型有机体大肠杆菌中的异构表达是新植物运输蛋白表征的理想系统。大肠杆菌的分子和生理特征是众所周知的。 分子工具和技术已经建立起来^。此外，不同的表达载体，非致病菌株和突变体可用17，18，19。此外，大肠杆菌具有高生长率，在实验室条件下很容易生长。许多蛋白质在大肠杆菌⁹中易于表达和纯化。当蛋白质不能直接在细胞系统中被测定时，将蛋白质重组成脂质体也是一次成功的创新，尽管对于纯化膜蛋白的表征来说也是一项成功的创新。利用该模型系统^20、21，完成了植物线粒体运输蛋白的功能表征，包括大豆、玉米、水稻和阿拉伯兰多普西的磷酸盐输送剂等溶质运输剂，在阿拉伯拟南芥中实现了二甲苯甲酸酯-三甲苯酯载体的功能特征。然而，在重组实验中发现番茄蛋白SICAT9的重组蛋白不起作用，而CAT运输体家族的其他成员在Xenopus卵母细胞测定²²中被发现无功能。因此，需要额外的分子工具来表征膜输送机。

在大肠杆菌²³中发现了5个多胺运输系统。其中包括两名ABC运输商，负责调解精氨酸和普赖辛的摄入，一个放流剂/苯基交换器，一个尸体/赖氨酸交换器，一个精氨酸出口商和一个放流剂进口商。Putrescine交换器PotE最初使用囊泡测定，其中内向外囊泡由裂化细胞与法国印刷机和测量放射性标记putresin到囊泡的吸收，以换取卵泡^24。囊泡测定也用于表征钙输送机，该因子在质子梯度²⁵的响应下调节钙的传递。这些实验促使我们制定了一种对其他多胺交换器进行表征的策略。我们首先在PotE和CadB交换器中制造了大肠杆菌缺乏菌株。在这里，我们演示了植物多胺抗剂的功能表征，通过修饰后的大肠杆菌菌株中的异质表达、使用法国印刷机生成膜囊泡以及放射性标记检测。