Lipidomics og transcriptomics i neurologiske sygdomme

Nylige fremskridt inden for lipidernes funktion og deres rolle i begyndelsen og udviklingen af neurologiske sygdomme åbner nye forsknings- og udviklingssteder for nye terapeutiske mål og sygdomsmekanismeudredning1. Dokumenterede forskelle i lipidsammensætning i forskellige hjerneområder, understreget af moderne molekylære billeddannelsesteknikker såsom massespektrometribilleddannelse og avanceret massespektrometriprofilering, skifter paradigmet for lipidundersøgelse fra hele hjernen mod funktionelt adskilte og diskrete hjerneområder. Det faktum, at lipidsammensætningen varierer i forskellige hjerneområder, medfører ny konceptualisering af både membranlipidfølsomhed og nedstrøms lipidsignalering som reaktion på en hjernefornærmelse eller stimuli på tværs af de funktionelt forskellige hjerneområder. Derfor kræver lipidprotokoller nye udviklinger for at imødegå udfordringen med lave vævsmængder til detektion og kvantificering af højere rumlig opløsning og samtidig analyse af flere lipidkomponenter i cellemembraner og signalveje. Bestemmelse af enzymer, lipidligander og receptorer, der er involveret i reguleringen af deres niveauer og funktion, er også afgørende for at belyse de signalveje, der er berørt af en neurologisk sygdom, og guide nye mekanistiske undersøgelser i en patofysiologisk sammenhæng.

Ud over den øgede hjerne rumlige opløsning er der to store vanskeligheder, der udfordrer udviklingen af nye neurolipidomiske tilgange. For det første er lipidsignalmolekylerne typisk af meget lav overflod sammenlignet med membrankonstitutive lipider. For det andet udviser lipidomet en høj strukturel heterogenitet, vanskelig at dissekere ved hjælp af en enkelt analytisk tilgang. Derfor er ekstraktions- og analysemetoder skræddersyet til forskellige lipidkategorier og udføres almindeligvis i forskellige vævsprøver². Shotgun lipidomiske metoder³ er fremragende værktøjer til hurtigt at afsløre en bred profil af membranlipider, mens øget følsomhed og selektivitet, der ydes af de målrettede opdagelses- og kvantificeringsmassespektrometriske metoder, udnyttes til undersøgelse af lavt rigelige signallipider, herunder: i) inflammatoriske lipider og ii) lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom endocannabinoider (eCB’er), aminosyrebundne lipider, osv.^4,5. For at omfatte lipidændringer på både cellemembranen og signalniveau, der forekommer i hjerneområder af neurologiske sygdomsmodeller, udføres typisk lipidekstraktion og analyse i forskellige vævsprøver, opnået fra forskellige dyrepartier eller fra forskellige halvkugler eller ved at dissekere en større vævsregion i flere stykker. Når mRNA-niveauer af enzymreceptorer også er af interesse, kræver deres undersøgelse typisk indkøb af en særskilt vævsprøve. For eksempel ville undersøgelsen af membranlipider, endogene cannabinoider og mRNA kræve tre forskellige vævsprøver (f.eks. To prøver til de to lipidekstraktionsmetoder – membranlipider og signallipider – og efterfølgende to lipidanalysemetoder – og en prøve til mRNA-analyse). Undersøgelse af inflammatoriske lipider og endogene cannabinoider kræver henholdsvis to forskellige vævsprøver, ekstraktionsmetoder og analysemetoder. Et andet eksempel er undersøgelsen af mRNA og af enhver lipidkategori i en hjernestans eller lasermikrodissektionsprøve, som derfor kræver, at to forskellige dyr indkøber to prøver pr. Hjerne (sub)region. Der forekommer ofte en betydelig grad af variabilitet og/eller ringe reproducerbarhed af resultaterne i sådanne tilfælde som følge af biologisk variabilitet og/eller vævsheterogenitet. Styret af disse praktiske begrænsninger ved multimolekylær analyse, der især forekommer ved høj rumlig opløsning i hjernen, blev der designet en tre-modul neurolipidomics-protokol, der omfattede: 1) coextraktion og co-analyse af LC / MRM af inflammatoriske lipider (f.eks. Eicosanoider (eIC’er)) og lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom eCC’er²; 2) co-ekstraktion af phospholipider (PL’er) og eCC’er med efterfølgende multiscan LC/MRM og precursor/neutral loss scan analyse²; og 3) dobbelt ekstraktion af membran (phospho)lipider og eCB’er samt mRNA med efterfølgende LC/MRM- og qPCR- eller RNA-sekventeringsanalyse⁶. Afhængigt af det biologiske spørgsmål, der skal behandles i en neurologisk sygdom, og hjerneområdet af interesse kan en kombination af den første og den anden protokol eller den første og den tredje protokol anvendes på den samme vævsprøve for væv, der vejer omkring 4 mg. Den første og tredje protokol kan anvendes uafhængigt for væv omkring 2 mg. Den anden protokol kan anvendes til væv, der vejer så lidt som 0,5 mg. Uanset hvilket neurolipidomisk protokolmodul der vælges, er vævsprøveudtagning og præanalytisk behandling, hjerneisolering og regionsdissektion samt proceduren for ofring af dyremodellen standardiseret og identisk for alle tre moduler i protokollen. I vores undersøgelse af neurologiske sygdomme indsamles og analyseres perifere organer, der er relevante for sygdommens patologiske konsekvenser, altid også ved hjælp af disse modulære protokoller. Derudover udtages der regelmæssigt prøver af blod til plasmalipidomik for at tjene som et udlæsningsværktøj for neurologiske sygdomme med henblik på potentielle translationelle anvendelser. Den her præsenterede modulære lipidomics-protokol er meget alsidig: skalerbar til større vævsmængder og let anvendelig til stort set enhver vævstype og sygdom. Til anvendelse af den modulære protokol (Figur 1) i neurologiske sygdomme er enhver standardiseret gnavermodel for debut og progression af neurologiske lidelser, såsom traumatisk hjerneskade, Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom eller epilepsi, modtagelige.

Disse protokoller er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere ændringer i vævlipidomet og/eller transkriptomet i den akutte fase af epilepsi i den kainsyre (KA)-inducerede musemodel af ^epilepsi2,7, en model, der i vid udstrækning anvendes i prækliniske undersøgelser på grund af ligheden med human temporal lobe epilepsi (TLE)^8,9,10,11. Ved hjælp af disse protokoller blev det terapeutiske potentiale af lægemidler som Palmitoylethanolamid (PEA)^12,13 vurderet i den samme musemodel af epilepsi. Undersøgelsen identificerede lipid- og mRNA-ændringer ved høj og lav rumlig opløsning i hjernen og periferien, på tidspunktet for maksimale akutte anfaldsintensiteter (ved 60 minutters postbeslaglæggelsesinduktion) og ved subkronisk og akut behandling med PEA på fire forskellige tidspunkter (20, 60, 120 og 180 minutter) efter KA-anfaldsinduktion, et tidsvindue, der dækker den akutte fase af epilepsi. Plasma, hjerner og perifere organer fra ubehandlede KA-injicerede mus, akutte og subkronisk ærtebehandlede mus samt køretøjs- og PEA-køretøjskontrolmus blev indsamlet på hvert ^{tidspunkt12,13} og undersøgt med denne molekylære analyse. De molekylære data var korreleret med adfærdsmæssige fænotyper opnået ved anfaldsscoring såvel som med immunohistokemi-afledte data om neurodegenerative processer for at optrævle progressionen af den akutte epilepsifase og PEA’s potentiale til at lindre den.