Denne artikel præsenterer en modulær protokol for vævlipidomik og transkriptomik og plasmalipidomik i neurologiske sygdomsmusmodeller rettet mod lipider, der ligger til grund for inflammation og neuronal aktivitet, membranlipider, nedstrøms budbringere og mRNA-kodende enzymer / receptorer, der ligger til grund for lipidfunktionen. Prøveudtagnings-, prøvebehandlings-, ekstraktions- og kvantificeringsprocedurer er skitseret.
Lipider tjener som den primære grænseflade til hjernefornærmelser eller stimuli, der fremmer neurologiske sygdomme og er et reservoir til syntese af lipider med forskellige signal- eller ligandfunktion, der kan understrege sygdommens begyndelse og progression. Lipider, der ofte ændrer sig på det præsymptomatiske niveau, er en ny kilde til lægemiddelmål og biomarkører. Mange neurologiske sygdomme udviser neuroinflammation, neurodegeneration og neuronal excitabilitet som fælles kendetegn, delvis moduleret af specifikke lipidsignalsystemer. Den indbyrdes afhængighed og indbyrdes sammenhæng mellem syntese af forskellige lipider tilskynder til en multilipid-, multienzym- og multireceptoranalyse for at udlede fællestræk og specificiteter i neurologiske sammenhænge og for at fremskynde optrævlingen af mekanistiske aspekter af sygdomsdebut og progression. At tilskrive lipidroller til forskellige hjerneområder fremmer bestemmelsen af lipidmolekylær fænotype og morfologi forbundet med en neurologisk sygdom.
Præsenteret her er en modulær protokol, der er egnet til analyse af membranlipider og nedstrøms lipidsignaler sammen med mRNA af enzymer og mediatorer, der ligger til grund for deres funktionalitet, ekstraheret fra diskrete hjerneområder, der er relevante for en bestemt neurologisk sygdom og / eller tilstand. For at sikre nøjagtig komparativ lipidomisk profilering blev arbejdsgangene og driftskriterierne optimeret og standardiseret til: i) hjerneprøveudtagning og dissektion af regioner af interesse, ii) co-ekstraktion af flere lipidsignaler og membranlipider, iii) dobbelt lipid / mRNA-ekstraktion, iv) kvantificering ved væskekromatografi multiple reaction monitoring (LC / MRM) og v) standard mRNA-profilering. Denne arbejdsgang er egnet til de lave vævsmængder, der opnås ved prøveudtagning af de funktionelt diskrete hjerneunderregioner (dvs. ved hjernestansning), hvilket forhindrer bias i multimolekylær analyse på grund af vævsheterogenitet og / eller dyrevariabilitet. For at afsløre perifere konsekvenser af neurologiske sygdomme og etablere translationelle molekylære udlæsninger af neurologiske sygdomstilstande forfølges og beskrives også prøveudtagning af perifere organer, behandling og deres efterfølgende lipidomiske analyse samt plasmalipidomik. Protokollen er demonstreret på en akut epilepsimusemodel.
Nylige fremskridt inden for lipidernes funktion og deres rolle i begyndelsen og udviklingen af neurologiske sygdomme åbner nye forsknings- og udviklingssteder for nye terapeutiske mål og sygdomsmekanismeudredning1. Dokumenterede forskelle i lipidsammensætning i forskellige hjerneområder, understreget af moderne molekylære billeddannelsesteknikker såsom massespektrometribilleddannelse og avanceret massespektrometriprofilering, skifter paradigmet for lipidundersøgelse fra hele hjernen mod funktionelt adskilte og diskrete hjerneområder. Det faktum, at lipidsammensætningen varierer i forskellige hjerneområder, medfører ny konceptualisering af både membranlipidfølsomhed og nedstrøms lipidsignalering som reaktion på en hjernefornærmelse eller stimuli på tværs af de funktionelt forskellige hjerneområder. Derfor kræver lipidprotokoller nye udviklinger for at imødegå udfordringen med lave vævsmængder til detektion og kvantificering af højere rumlig opløsning og samtidig analyse af flere lipidkomponenter i cellemembraner og signalveje. Bestemmelse af enzymer, lipidligander og receptorer, der er involveret i reguleringen af deres niveauer og funktion, er også afgørende for at belyse de signalveje, der er berørt af en neurologisk sygdom, og guide nye mekanistiske undersøgelser i en patofysiologisk sammenhæng.
Ud over den øgede hjerne rumlige opløsning er der to store vanskeligheder, der udfordrer udviklingen af nye neurolipidomiske tilgange. For det første er lipidsignalmolekylerne typisk af meget lav overflod sammenlignet med membrankonstitutive lipider. For det andet udviser lipidomet en høj strukturel heterogenitet, vanskelig at dissekere ved hjælp af en enkelt analytisk tilgang. Derfor er ekstraktions- og analysemetoder skræddersyet til forskellige lipidkategorier og udføres almindeligvis i forskellige vævsprøver2. Shotgun lipidomiske metoder3 er fremragende værktøjer til hurtigt at afsløre en bred profil af membranlipider, mens øget følsomhed og selektivitet, der ydes af de målrettede opdagelses- og kvantificeringsmassespektrometriske metoder, udnyttes til undersøgelse af lavt rigelige signallipider, herunder: i) inflammatoriske lipider og ii) lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom endocannabinoider (eCB’er), aminosyrebundne lipider, osv.4,5. For at omfatte lipidændringer på både cellemembranen og signalniveau, der forekommer i hjerneområder af neurologiske sygdomsmodeller, udføres typisk lipidekstraktion og analyse i forskellige vævsprøver, opnået fra forskellige dyrepartier eller fra forskellige halvkugler eller ved at dissekere en større vævsregion i flere stykker. Når mRNA-niveauer af enzymreceptorer også er af interesse, kræver deres undersøgelse typisk indkøb af en særskilt vævsprøve. For eksempel ville undersøgelsen af membranlipider, endogene cannabinoider og mRNA kræve tre forskellige vævsprøver (f.eks. To prøver til de to lipidekstraktionsmetoder – membranlipider og signallipider – og efterfølgende to lipidanalysemetoder – og en prøve til mRNA-analyse). Undersøgelse af inflammatoriske lipider og endogene cannabinoider kræver henholdsvis to forskellige vævsprøver, ekstraktionsmetoder og analysemetoder. Et andet eksempel er undersøgelsen af mRNA og af enhver lipidkategori i en hjernestans eller lasermikrodissektionsprøve, som derfor kræver, at to forskellige dyr indkøber to prøver pr. Hjerne (sub)region. Der forekommer ofte en betydelig grad af variabilitet og/eller ringe reproducerbarhed af resultaterne i sådanne tilfælde som følge af biologisk variabilitet og/eller vævsheterogenitet. Styret af disse praktiske begrænsninger ved multimolekylær analyse, der især forekommer ved høj rumlig opløsning i hjernen, blev der designet en tre-modul neurolipidomics-protokol, der omfattede: 1) coextraktion og co-analyse af LC / MRM af inflammatoriske lipider (f.eks. Eicosanoider (eIC’er)) og lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom eCC’er2; 2) co-ekstraktion af phospholipider (PL’er) og eCC’er med efterfølgende multiscan LC/MRM og precursor/neutral loss scan analyse2; og 3) dobbelt ekstraktion af membran (phospho)lipider og eCB’er samt mRNA med efterfølgende LC/MRM- og qPCR- eller RNA-sekventeringsanalyse6. Afhængigt af det biologiske spørgsmål, der skal behandles i en neurologisk sygdom, og hjerneområdet af interesse kan en kombination af den første og den anden protokol eller den første og den tredje protokol anvendes på den samme vævsprøve for væv, der vejer omkring 4 mg. Den første og tredje protokol kan anvendes uafhængigt for væv omkring 2 mg. Den anden protokol kan anvendes til væv, der vejer så lidt som 0,5 mg. Uanset hvilket neurolipidomisk protokolmodul der vælges, er vævsprøveudtagning og præanalytisk behandling, hjerneisolering og regionsdissektion samt proceduren for ofring af dyremodellen standardiseret og identisk for alle tre moduler i protokollen. I vores undersøgelse af neurologiske sygdomme indsamles og analyseres perifere organer, der er relevante for sygdommens patologiske konsekvenser, altid også ved hjælp af disse modulære protokoller. Derudover udtages der regelmæssigt prøver af blod til plasmalipidomik for at tjene som et udlæsningsværktøj for neurologiske sygdomme med henblik på potentielle translationelle anvendelser. Den her præsenterede modulære lipidomics-protokol er meget alsidig: skalerbar til større vævsmængder og let anvendelig til stort set enhver vævstype og sygdom. Til anvendelse af den modulære protokol (Figur 1) i neurologiske sygdomme er enhver standardiseret gnavermodel for debut og progression af neurologiske lidelser, såsom traumatisk hjerneskade, Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom eller epilepsi, modtagelige.
Disse protokoller er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere ændringer i vævlipidomet og/eller transkriptomet i den akutte fase af epilepsi i den kainsyre (KA)-inducerede musemodel af epilepsi2,7, en model, der i vid udstrækning anvendes i prækliniske undersøgelser på grund af ligheden med human temporal lobe epilepsi (TLE)8,9,10,11. Ved hjælp af disse protokoller blev det terapeutiske potentiale af lægemidler som Palmitoylethanolamid (PEA)12,13 vurderet i den samme musemodel af epilepsi. Undersøgelsen identificerede lipid- og mRNA-ændringer ved høj og lav rumlig opløsning i hjernen og periferien, på tidspunktet for maksimale akutte anfaldsintensiteter (ved 60 minutters postbeslaglæggelsesinduktion) og ved subkronisk og akut behandling med PEA på fire forskellige tidspunkter (20, 60, 120 og 180 minutter) efter KA-anfaldsinduktion, et tidsvindue, der dækker den akutte fase af epilepsi. Plasma, hjerner og perifere organer fra ubehandlede KA-injicerede mus, akutte og subkronisk ærtebehandlede mus samt køretøjs- og PEA-køretøjskontrolmus blev indsamlet på hvert tidspunkt12,13 og undersøgt med denne molekylære analyse. De molekylære data var korreleret med adfærdsmæssige fænotyper opnået ved anfaldsscoring såvel som med immunohistokemi-afledte data om neurodegenerative processer for at optrævle progressionen af den akutte epilepsifase og PEA’s potentiale til at lindre den.
Den neurolipidomiske og transkriptomiske metode, der er beskrevet her, er et levedygtigt middel til at undersøge enhver sygdom eller sund udvikling ved høj og lav rumlig opløsning i hjernen og perifere organer. På grund af de optimerede plasmaprøveudtagnings- og håndteringsprocedurer kan plasmalipidomisk analyse også udføres fra de samme dyr, der ofres for vævlipidomik og transkriptomik, hvilket forbedrer pålideligheden af vævsblodmolekylære korrelater og biomarkøropdagelse. Tilvejebringelsen af et bredt dat…
The authors have nothing to disclose.
Vi dedikerer denne artikel til Dr. Ermelinda Lomazzo. Under færdiggørelsen af dette manuskript døde Dr. Ermelinda Lomazzo. Hun er legemliggørelsen af lidenskab for videnskab og uselvisk engagement i teamwork for at opfylde et meningsfuldt forskningsformål. Hun har altid drømt om at bidrage meningsfuldt til menneskers større trivsel. Hendes godhjertede natur blev aldrig kompromitteret af videnskabens og livets anstrengende veje. Hun vil forblive uvurderlig og for evigt i vores hjerter.
Julia M. Post blev finansieret af Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) ved University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz og er i øjeblikket finansieret af SPP-2225 EXIT-projektet til LB. Raissa Lerner blev delvist finansieret af DZHK-projekt 81X2600250 til LB og Lipidomics Core Facility. Delvis finansiering til disse undersøgelser blev ydet af Lipidomics Core Facility, Institut for Fysiologisk Kemi og Intramurale midler (til LB) fra University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz.
12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
Bino | Zeiss | Microscopy | |
cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
Motic Camara | Motic | Microscopy | |
MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |