Lipidomics en Transcriptomics bij neurologische aandoeningen

Recente ontwikkelingen in de functie van lipiden en hun rol in het begin en de progressie van neurologische ziekten openen nieuwe onderzoeks- en ontwikkelingslocaties van nieuwe therapeutische doelen en opheldering van het ^{ziektemechanisme1}. Gedocumenteerde verschillen in lipidesamenstelling in verschillende hersengebieden, benadrukt door moderne moleculaire beeldvormingstechnieken zoals massaspectrometrie beeldvorming en geavanceerde massaspectrometrieprofilering, verschuift het paradigma van lipidenonderzoek van hele hersenen naar functioneel verschillende en discrete hersengebieden. Het feit dat de lipidesamenstelling varieert in verschillende hersengebieden leidt tot nieuwe conceptualisering van zowel membraanlipidegevoeligheid als stroomafwaartse lipidesignalering als reactie op een hersenbelediging of stimuli in de functioneel verschillende hersengebieden. Daarom vereisen lipideprotocollen nieuwe ontwikkelingen om de uitdaging van lage weefselhoeveelheden aan te pakken voor detectie en kwantificering met een hogere ruimtelijke resolutie, en tegelijkertijd analyse van meerdere lipidecomponenten van celmembranen en signaalroutes. Ook de bepaling van enzymen, lipideliganden en receptoren die betrokken zijn bij de regulatie van hun niveaus en functie is van het grootste belang om de signaalroutes die bij een neurologische ziekte worden beïnvloed, op te helderen en nieuwe mechanistische onderzoeken in een pathofysiologische context te begeleiden.

Naast de verhoogde ruimtelijke resolutie van de hersenen, zijn er twee grote problemen die de ontwikkeling van nieuwe neurolipidomische benaderingen uitdagen. Ten eerste zijn de lipide-signaleringsmoleculen meestal van zeer lage abundantie in vergelijking met membraanvormende lipiden. Ten tweede vertoont het lipidoom een hoge structurele heterogeniteit, moeilijk te ontleden met behulp van een enkele analytische benadering. Daarom zijn extractie- en analysemethoden afgestemd op verschillende lipidecategorieën en worden ze vaak uitgevoerd in verschillende weefselmonsters². Shotgun lipidomische methoden³ zijn uitstekende hulpmiddelen om snel een breed profiel van membraanlipiden te onthullen, terwijl verhoogde gevoeligheid en selectiviteit die worden geboden door de gerichte ontdekking en kwantificering massaspectrometrische methoden worden benut voor onderzoek van laag overvloedige signaallipiden, waaronder: i) inflammatoire lipiden en ii) lipiden die betrokken zijn bij de modulatie van neuronale activiteit, zoals endocannabinoïden (eCB’s), aminozuurgerelateerde lipiden, enz.^4,5. Om lipideveranderingen op zowel het celmembraan als het signaleringsniveau te omvatten die optreden in hersengebieden van neurologische ziektemodellen, worden de lipide-extractie en -analyse meestal uitgevoerd in verschillende weefselmonsters, verkregen uit verschillende dierlijke batches of uit verschillende hemisferen, of door een groter weefselgebied in meerdere stukken te ontleden. Wanneer mRNA-niveaus van enzymreceptoren ook van belang zijn, vereist hun onderzoek meestal de verkrijging van een afzonderlijk weefselmonster. Het onderzoek van membraanlipiden, endogene cannabinoïden en mRNA zou bijvoorbeeld drie verschillende weefselmonsters vereisen (bijvoorbeeld twee monsters voor de twee lipide-extractiemethoden – membraanlipiden en signaleringslipiden – en daaropvolgende twee lipidenanalysemethoden – en één monster voor mRNA-analyse). Onderzoek naar inflammatoire lipiden en endogene cannabinoïden vereist respectievelijk twee verschillende weefselmonsters, extractiemethoden en analysemethoden. Een ander voorbeeld is het onderzoek van mRNA en van elke lipidecategorie in een hersenpunch- of lasermicrodissectiemonster, waardoor twee verschillende dieren twee monsters per hersengebied (sub)regio moeten verkrijgen. Een aanzienlijke mate van variabiliteit en/of slechte reproduceerbaarheid van de resultaten komt in dergelijke gevallen vaak voor, als gevolg van biologische variabiliteit en/of weefselheterogeniteit. Geleid door deze praktische beperkingen van multimoleculaire analyse, die met name optreden bij hoge ruimtelijke resolutie in de hersenen, werd een driemodule neurolipidomicsprotocol ontworpen dat omvat: 1) co-extractie en co-analyse door LC / MRM van inflammatoire lipiden (bijv. Eicosanoïden (eiCs)) en lipiden die betrokken zijn bij modulatie van neuronale activiteit, zoals eCB’s²; 2) co-extractie van fosfolipiden (PR’s) en eCB’s met daaropvolgende multiscan LC/MRM en precursor/neutrale verliesscananalyse²; en 3) dubbele extractie van membraan (fosfo)lipiden en eCB’s, evenals mRNA, met daaropvolgende LC/MRM en qPCR of RNA sequencing analyse⁶. Afhankelijk van de biologische vraag die moet worden behandeld bij een neurologische ziekte en het hersengebied van belang, kan een combinatie van het eerste en het tweede protocol, of het eerste en het derde protocol, worden toegepast op hetzelfde weefselmonster voor weefsels met een gewicht van ongeveer 4 mg. Het eerste en derde protocol kunnen onafhankelijk worden toegepast voor weefsels rond 2 mg. Het tweede protocol kan worden toegepast voor weefsels met een gewicht van slechts 0,5 mg. Ongeacht de geselecteerde neurolipidomische protocolmodule zijn de weefselbemonstering en pre-analytische verwerking, de hersenisolatie en regiodissectie, evenals de procedure voor het opofferen van het diermodel gestandaardiseerd en identiek voor alle drie de modules van het protocol. In ons onderzoek naar neurologische aandoeningen worden perifere organen die relevant zijn voor de pathologische gevolgen van de ziekte altijd ook verzameld en geanalyseerd met behulp van deze modulaire protocollen. Bovendien wordt bloed regelmatig bemonsterd voor plasmalipideomica om te dienen als een uitleesinstrument van neurologische ziekten met het oog op prospectieve translationele toepassingen. Het hier gepresenteerde modulaire lipidomics-protocol is zeer veelzijdig: schaalbaar naar grotere weefselhoeveelheden en gemakkelijk toepasbaar voor vrijwel elk weefseltype en elke ziekte. Voor de toepassing van het modulaire protocol (Figuur 1) bij neurologische ziekten is elk gestandaardiseerd knaagdiermodel van het begin en de progressie van neurologische aandoeningen, zoals traumatisch hersenletsel, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer of epilepsie vatbaar.

Deze protocollen zijn uitgebreid toegepast om veranderingen in het weefsellipideoom en /of transcriptoom in de acute fase van epilepsie te bestuderen in het door kaïnzuur (KA) geïnduceerde muismodel van ^epilepsie2,7, een model dat veel wordt gebruikt in preklinische studies vanwege de gelijkenis met humane temporale kwab epilepsie (TLE)^8,9,10,11. Met behulp van deze protocollen werd het therapeutisch potentieel van geneesmiddelen zoals Palmitoylethanolamide (PEA)^12,13 beoordeeld in hetzelfde muismodel van epilepsie. De studie identificeerde lipide- en mRNA-veranderingen bij hoge en lage ruimtelijke resolutie in de hersenen en periferie, op het tijdstip van maximale acute aanvalsintensiteiten (bij 60 min posteizure inductie), en bij subchronische en acute behandeling met PEA op vier verschillende tijdstippen (20, 60, 120 en 180 min) na KA-aanvalsinductie, een tijdvenster dat de acute fase van epilepsie bestrijkt. Plasma, hersenen en perifere organen van onbehandelde KA-geïnjecteerde muizen, acute en subchronisch PEA-behandelde muizen, evenals voertuig- en PEA-voertuigcontrolemuizen, werden verzameld op elk ^{tijdstip12,13} en onderzocht met deze moleculaire analyse. De moleculaire gegevens werden gecorreleerd met gedragsfenotypen verkregen door het scoren van aanvallen, evenals met immunohistochemische afgeleide gegevens over neurodegeneratieve processen, om de progressie van de acute epilepsiefase en het potentieel van PEA om het te verlichten te ontrafelen.