Липидомика и транскриптомика при неврологических заболеваниях

Последние достижения в области функции липидов и их роли в возникновении и прогрессировании неврологических заболеваний открывают новые научно-исследовательские и опытно-конструкторские площадки для новых терапевтических мишеней и выяснения механизмов ^{заболевания1}. Задокументированные различия в липидном составе в разных областях мозга, подчеркнутые современными методами молекулярной визуализации, такими как масс-спектрометрическая визуализация и расширенное профилирование масс-спектрометрии, смещают парадигму исследования липидов от всего мозга к функционально различным и дискретным областям мозга. Тот факт, что липидный состав варьируется в разных областях мозга, вызывает новую концептуализацию как мембранной липидной чувствительности, так и последующей липидной сигнализации в ответ на повреждение мозга или стимулы в функционально различных областях мозга. Следовательно, липидные протоколы требуют новых разработок для решения проблемы низких количеств тканей для обнаружения и количественной оценки с более высоким пространственным разрешением и одновременно анализа нескольких липидных компонентов клеточных мембран и сигнальных путей. Кроме того, определение ферментов, липидных лигандов и рецепторов, участвующих в регуляции их уровней и функций, имеет первостепенное значение для выяснения сигнальных путей, затронутых неврологическим заболеванием, и руководства новыми механистическими исследованиями в патофизиологическом контексте.

В дополнение к увеличению пространственного разрешения мозга, существуют две основные трудности, бросающие вызов разработке новых нейролипидомных подходов. Во-первых, липидные сигнальные молекулы, как правило, имеют очень низкое содержание по сравнению с мембранными конститутивными липидами. Во-вторых, липидом проявляет высокую структурную гетерогенность, которую трудно препарировать с помощью одного аналитического подхода. Следовательно, методы экстракции и анализа адаптированы к различным категориям липидов и обычно выполняются в разных образцах тканей.². Липидомические методы дробовика³ являются отличными инструментами для быстрого выявления широкого профиля мембранных липидов, в то время как повышенная чувствительность и селективность, обеспечиваемые целенаправленными методами открытия и количественной оценки масс-спектрометрических методов, используются для исследования низкообильных сигнальных липидов, включая: i) воспалительные липиды и ii) липиды, участвующие в модуляции нейрональной активности, такие как эндоканнабиноиды (eCB), аминокислотно-связанные липиды, и так далее.^4,5. Чтобы охватить изменения липидов как на клеточной мембране, так и на уровне сигнализации, происходящие в областях мозга моделей неврологических заболеваний, обычно экстракция и анализ липидов проводятся в отдельных образцах тканей, полученных из различных партий животных или из разных полушарий, или путем рассечения более крупной области ткани на несколько частей. Когда уровни мРНК ферментных рецепторов также представляют интерес, их исследование обычно требует получения отдельного образца ткани. Например, исследование мембранных липидов, эндогенных каннабиноидов и мРНК потребует трех различных образцов тканей (например, двух образцов для двух методов экстракции липидов – мембранных липидов и сигнальных липидов – и последующих двух методов анализа липидов – и одного образца для анализа мРНК). Исследование воспалительных липидов и эндогенных каннабиноидов требует двух различных образцов тканей, методов экстракции и методов анализа, соответственно. Другим примером является исследование мРНК и любой липидной категории в образце мозгового пунша или лазерной микродиссекции, что, следовательно, требует, чтобы два разных животных получали два образца на (под)область мозга. В таких случаях часто наблюдается значительная степень изменчивости и/или плохой воспроизводимости результатов, обусловленная биологической изменчивостью и/или неоднородностью тканей. Руководствуясь этими практическими ограничениями многомолекулярного анализа, происходящими, в частности, при высоком пространственном разрешении в головном мозге, был разработан трехмодульный протокол нейролипидомики, охватывающий: 1) коэкстракцию и совместный анализ LC / MRM воспалительных липидов (например, эйкозаноидов (EIC)) и липидов, участвующих в модуляции нейронной активности, таких как eCB²; 2) совместная экстракция фосфолипидов (ПЛ) и eCB с последующим мультисканированием LC/MRM и прекурсором/нейтральным анализом потерь²; и 3) двойная экстракция мембранных (фосфо)липидов и eCB, а также мРНК с последующим анализом секвенирования LC/MRM и qPCR или РНК⁶. В зависимости от биологического вопроса, подлежащего решению при неврологическом заболевании и интересующей области мозга, комбинация первого и второго протокола или первого и третьего протокола может быть применена к одному и тому же образцу ткани для тканей весом около 4 мг. Первый и третий протоколы могут быть независимо применены для тканей около 2 мг. Второй протокол может быть применен для тканей весом всего 0,5 мг. Независимо от выбранного модуля нейролипидомного протокола, забор тканей и преаналитическая обработка, выделение мозга и рассечение области, а также процедура жертвоприношения животной модели стандартизированы и идентичны для всех трех модулей протокола. В нашем исследовании неврологических заболеваний периферические органы, которые имеют отношение к патологическим последствиям заболевания, всегда также собираются и анализируются с использованием этих модульных протоколов. Кроме того, кровь регулярно отбирается для плазменной липидомики, чтобы служить инструментом считывания неврологических заболеваний с целью перспективного трансляционного применения. Представленный здесь модульный протокол липидомики очень универсален: масштабируется до больших количеств тканей и легко применим практически для любого типа тканей и заболевания. Для применения модульного протокола (Рисунок 1) при неврологических заболеваниях любая стандартизированная модель грызунов начала и прогрессирования неврологических расстройств, таких как черепно-мозговая травма, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или эпилепсия, поддаются лечению.

Эти протоколы широко применялись для изучения изменений в тканевом липидоме и/или транскриптоме в острой фазе эпилепсии в мышиной модели эпилепсии, индуцированной кайновой кислотой (КА^)2,7, модели, широко используемой в доклинических исследованиях из-за сходства с эпилепсией височной доли человека (TLE)^8,9,10,11. Используя эти протоколы, терапевтический потенциал таких препаратов, как Пальмитоилэтаноламид (ПЭА)^12,13, оценивали в той же мышиной модели эпилепсии. Исследование выявило изменения липидов и мРНК при высоком и низком пространственном разрешении в мозге и периферии, в точке максимальной интенсивности острых приступов (при 60 мин после индукции после захвата) и при субхроническом и остром лечении ПЭА в четырех различных временных точках (20, 60, 120 и 180 мин) после индукции KA-припадка, временное окно, охватывающее острую фазу эпилепсии. Плазма, мозг и периферические органы необработанных мышей, введенных к КА, острых и субхронически обработанных ПЭА мышей, а также контрольных мышей с транспортным средством и ПЭА-транспортным средством, были собраны в каждый момент ^{времени12,13} и исследованы с помощью этого молекулярного анализа. Молекулярные данные коррелировали с поведенческими фенотипами, полученными с помощью оценки судорог, а также с данными иммуногистохимии о нейродегенеративных процессах, чтобы разгадать прогрессирование фазы острой эпилепсии и потенциал ПЭА для ее облегчения.