Identificatie van Orexin en endocannabinoïde receptoren bij volwassen zebravis met behulp van immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie methoden

Immunohistochemistry (IHC) is een goed gevestigde klassieke techniek die wordt gebruikt om cellulaire of weefsel componenten (antigenen) te identificeren door antigeen-antilichaam interactie^1,2. Het kan worden gebruikt om de lokalisatie en distributie van target biomoleculen te identificeren in een tissue. IHC gebruikt immunologische en chemische reacties om antigenen op te sporen in weefselsecties³. De belangrijkste tellers die voor de visualisatie van antigeen-antilichaam interactie worden gebruikt omvatten fluorescente kleurstoffen (immunofluorescentie) en enzym-substraat kleuren Reacties (immunoperoxidasekleuring), allebei geconjugeerd aan antilichamen⁴. Het gebruiken van microscopische observatie is mogelijk om de localisatie van geëtiketteerd weefsel te bepalen, dat ongeveer aan localisatie van het doel antigeen in het weefsel beantwoordt.

Twee methodes bestaan voor fluorescente of chromogene reacties om proteïne te ontdekken: de directe opsporingsmethode, waarin het specifieke primaire antilichaam direct wordt geëtiketteerde; en de indirecte opsporingsmethode, waarin het primaire antilichaam ongeconjugeerd is terwijl het secundaire antilichaam het etiket^5,6,7draagt. De indirecte methode heeft sommige voordelen, die hoofdzakelijk zijn signaal versterking is. Bovendien, in tegenstelling tot andere moleculaire en cellulaire technieken, met immunofluorescentie, is het mogelijk om de distributie, de localisatie, en de coexpressie van twee of meer proteïnen te visualiseren die differentieel binnen cellen en weefsels worden uitgedrukt⁷. De keuze van de gebruikte detectiemethode is afhankelijk van experimentele Details.

Tot op heden, wordt IHC wijd gebruikt in fundamenteel onderzoek als krachtig en essentieel hulpmiddel om de distributie en de localisatie van biomarkers en het algemene profileren van verschillende proteïnen in biologisch weefsel van mens aan ongewervelden te begrijpen^{8, 9 , 10 , 11}. de techniek helpt een kaart van eiwituitdrukking in een groot aantal normale en veranderde dierlijke organen en verschillende weefseltypes tonen, die mogelijke beneden-of omhoog-regulering van uitdrukking tonen die door fysiologische en pathologische veranderingen wordt veroorzaakt. IHC is een zeer gevoelige techniek die nauwkeurigheid en de juiste keuze van methoden vereist om optimale resultaten te verkrijgen¹². Eerst en vooral, kunnen vele verschillende factoren zoals bevestiging, dwars-reactiviteit, antigeen herwinning, en gevoeligheid van antilichamen tot valse positieve en valse negatieve signalen¹³leiden. De selectie van de antilichamen is één van de belangrijkste stappen in IHC en hangt van de antigeenspecificiteit en zijn affiniteit af aan de proteïne en de soorten onder onderzoek⁷.

Onlangs, hebben wij de IHC techniek geoptimaliseerd om leden van orexin/hypocretine en endocannabinoïde systemen in volwassen zebravis weefsel te ontdekken. We hebben vooral gericht op fixatie, weefsel inbedding met behulp van twee verschillende benaderingen, secties en montage (die van invloed kunnen zijn resolutie en detail tijdens microscopische analyse), en het blokkeren (om valse positieven te voorkomen en te verminderen achtergrond)¹⁴. Andere belangrijke kenmerken zijn de antilichamenspecificiteit en selectiviteit en reproduceerbaarheid van individuele IHC protocollen. De sleutel tot het verstrekken van antilichaam specificiteit is het gebruik van negatieve controles (met inbegrip van geen primaire antilichamen of weefsel waarvan bekend is dat niet de doelstelling eiwitten uitdrukken), alsmede positieve controles (met inbegrip van weefsel dat bekend is om de doel-eiwitten uit te drukken)¹⁵ . De selectie van antilichamen voor IHC wordt gemaakt op basis van hun soort-specificiteit (de waarschijnlijkheid waarmee zij met het antigeen van belang reageren) en de antigeen-antilichaam bindende opsporingssystemen die^{4,5,6 worden gebruikt ,7}. In het geval van immunoperoxidasekleuring, wordt de kleur van de reactie bepaald door selectie van neerslaan chromogeen, gewoonlijk diaminobenzidine (bruin)¹⁶. Enerzijds, gebruikt immunofluorescence antilichamen die met een fluorophor worden vervoegd om eiwituitdrukking in bevroren weefselsecties te visualiseren en maakt voor gemakkelijke analyse van veelvoudige proteïnen met betrekking tot het chromogene opsporingssysteem mogelijk ^{5 , 7}.

In de immunoperoxidasekleuring techniek, het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan biotine, een linker molecuul in staat van aanwerving van een chromogene reporter molecule [avidin-Biotine complex (ABC)], wat leidt tot versterking van de kleuring signaal. Met de ABC reporter methode, reageert het enzym peroxidase met 3, 3 ‘-diaminobenzidine (schar), producerend een intens bruin-gekleurde kleuring waar het enzym aan het secundaire antilichaam bindt, dat dan met een gewone lichte Microscoop kan worden geanalyseerd. ABC die, wegens de hoge affiniteit van avidin voor Biotine bevlekt, veroorzaakt een snelle en optimale reactie, met weinig secundaire antilichamen verbonden aan de plaats van de primaire antilichaam reactiviteit. Deze chromogene detectiemethode zorgt voor de densitometric analyse van het signaal, het verstrekken van semi-kwantitatieve gegevens op basis van de correlatie van bruine signaalniveaus met eiwitexpressie niveaus¹⁸.

Met immunofluorescentie technieken, gelijktijdige opsporing van veelvoudige proteïnen is mogelijk toe te schrijven aan de capaciteit van verschillende fluorochromes om licht bij unieke golflengten uit te stoten, maar is belangrijk om fluorochromes zorgvuldig te kiezen om spectrale overlapping ^{te minimaliseren 5}. Bovendien minimaliseert het gebruik van primaire antilichamen in verschillende gastheer soorten problemen met betrekking tot cross-reactiviteit. In dit geval, erkent elk soort-specifiek secundair antilichaam slechts één type van primair antilichaam. Fluorescerende verslaggevers zijn kleine organische moleculen, waaronder commerciële derivaten, zoals Alexa Fluor kleurstoffen.

Vele dierlijke modellen worden gebruikt om bepaalde fysiologische en pathologische voorwaarden te begrijpen. Tot op heden is vastgesteld dat veel metabole routes worden bewaard in de loop van de evolutie. Daarom kan IHC studies in modelorganismen zoals zebravis inzicht verschaffen in het ontstaan en het onderhoud van pathologische en niet-pathologische omstandigheden¹⁷. Het is een doel van dit rapport om IHC-protocollen te illustreren die kunnen worden uitgevoerd op volwassen zebravis weefsel en worden gebruikt om gedetailleerde beelden te verkrijgen van de distributie en lokalisatie van OXA, OX-2R en CB1R op perifere en centrale niveaus. Ook gemeld zijn protocollen voor de toepassing van twee grote IHC indirecte methoden in perifere en centrale weefsels van volwassen zebravis. Beschreven is de indirecte methode, die voor signaal versterking in gevallen toestaat waar een secundair antilichaam aan een fluorescente kleurstof (immunofluorescentie methode) of enzym Reporter (immunoperoxidasekleuring methode) wordt vervoegd. Zowel chromogene als fluorescente opsporingsmethodes bezitten voordelen en nadelen. Gerapporteerd in dit protocol is het gebruik van IHC, hoofdzakelijk immunofluorescentie, in volwassen zebravis, een dierlijk model dat wijd wordt gebruikt om systemen te bestuderen die evolutief behouden over verschillende fysiologische en pathologische voorwaarden zijn.