Identification des récepteurs d'orexine et d'endocannabinoïdes chez le poisson zèbre adulte à l'aide de méthodes d'immunoperoxidase et d'immunofluorescence

L’immunohistochimie (IHC) est une technique classique bien établie utilisée pour identifier les composants cellulaires ou tissulaires (antigènes) par interaction antigène-anticorps^1,2. Il peut être utilisé pour identifier la localisation et la distribution des biomolécules cibles dans un tissu. Le CSI utilise des réactions immunologiques et chimiques pour détecter les antigènes dans les sections tissulaires³. Les principaux marqueurs utilisés pour la visualisation des interactions antigène-anticorps comprennent les colorants fluorescents (immunofluorescence) et les réactions de couleur enzyme-substrat (immunoperoxidase), tous deux conjugués aux anticorps⁴. L’utilisation de l’observation microscopique est possible pour déterminer la localisation des tissus étiquetés, ce qui correspond approximativement à la localisation de l’antigène cible dans le tissu.

Deux méthodes existent pour les réactions fluorescentes ou chromogéniques pour détecter les protéines : la méthode de détection directe, dans laquelle l’anticorps primaire spécifique est directement étiqueté; et la méthode de détection indirecte, dans laquelle l’anticorps primaire est non conjugué tandis que l’anticorps secondaire porte l’étiquette^5,6,7. La méthode indirecte présente certains avantages, qui sont principalement son amplification du signal. En outre, contrairement à d’autres techniques moléculaires et cellulaires, avec l’immunofluorescence, il est possible de visualiser la distribution, la localisation et la coexpression de deux protéines ou plus exprimées différemment dans les cellules et les tissus⁷. Le choix de la méthode de détection utilisée dépend des détails expérimentaux.

À ce jour, iHC est largement utilisé dans la recherche fondamentale comme un outil puissant et essentiel pour comprendre la distribution et la localisation des biomarqueurs et le profilage général des différentes protéines dans les tissus biologiques de l’homme aux invertébrés^{8, 9} (en) ^{, 10} Ans et plus ^{, 11}. La technique aide à afficher une carte de l’expression des protéines dans un grand nombre d’organes animaux normaux et altérés et de différents types de tissus, montrant la possibilité de descendre ou de modifier l’expression induite par des changements physiologiques et pathologiques. IHC est une technique très sensible qui nécessite une précision et le bon choix de méthodes pour obtenir des résultats optimaux¹². Tout d’abord, de nombreux facteurs différents tels que la fixation, la réactivité croisée, la récupération d’antigènes et la sensibilité des anticorps peuvent conduire à de faux signaux positifs et faux négatifs¹³. La sélection des anticorps est l’une des étapes les plus importantes du CSI et dépend de la spécificité de l’antigène et de son affinité avec les protéines et les espèces à l’étude⁷.

Récemment, nous avons optimisé la technique du CSI pour détecter les membres de l’orexine/hypocrétine et des systèmes endocannabinoïdes dans le tissu adulte de poisson zèbre. Nous nous sommes concentrés principalement sur la fixation, l’intégration tissulaire à l’aide de deux approches différentes, la section et le montage (qui peuvent affecter la résolution et le détail lors de l’analyse microscopique), et le blocage (pour prévenir les faux positifs et réduire le fond)¹⁴. D’autres caractéristiques importantes sont la spécificité et la sélectivité des anticorps et la reproductibilité des protocoles individuels du Ci-Ph. La clé pour fournir la spécificité d’anticorps est l’utilisation des contrôles négatifs (y compris aucun anticorps primaire ou tissu qui est connu pour ne pas exprimer les protéines cibles) aussi bien que des contrôles positifs (y compris le tissu qui est connu pour exprimer les protéines cibles)¹⁵ . La sélection des anticorps pour iHC est faite en fonction de leur spécificité de l’espèce (la probabilité avec laquelle ils réagissent avec l’antigène d’intérêt) et des systèmes de détection de liaison antigène-anticorps qui sont utilisés^{4,5,6 ,7}. Dans le cas de l’immunoperoxidase, la couleur de la réaction est déterminée par la sélection du chromogène précipitant, habituellement diaminobenzidine (brun)¹⁶. D’autre part, immunofluorescence utilise des anticorps conjugués avec un fluorophor pour visualiser l’expression des protéines dans les sections de tissus congelés et permet une analyse facile de protéines multiples en ce qui concerne le système de détection chromogénique ^{5 Annonces , 7}.

Dans la technique d’immunoperoxidase, l’anticorps secondaire est conjugué à la biotine, une molécule de liaison capable de recruter une molécule journaliste chromogénique [complexe d’avidin-biotine (ABC)], conduisant à l’amplification du signal de coloration. Avec la méthode de journaliste d’ABC, l’enzyme peroxidase réagit avec 3,3′-diaminobenzidine (DAB), produisant une coloration intensément brune où l’enzyme se lie à l’anticorps secondaire, qui peut alors être analysée avec un microscope léger ordinaire. La coloration d’ABC, due à la forte affinité de l’avidine pour la biotine, produit une réaction rapide et optimale, avec peu d’anticorps secondaires attachés au site de la réactivité primaire d’anticorps. Cette méthode de détection chromogénique permet l’analyse densitométrique du signal, fournissant des données semi-quantitatives basées sur la corrélation des niveaux de signal brun avec les niveaux d’expression protéique¹⁸.

Avec les techniques d’immunofluorescence, la détection simultanée de protéines multiples est possible en raison de la capacité de différents fluorochromes à émettre de la lumière à des longueurs d’onde uniques, mais il est important de choisir les fluorochromes avec soin pour minimiser les chevauchements ^{spectrals 5}. En outre, l’utilisation d’anticorps primaires chez différentes espèces hôtes minimise les difficultés liées à la réactivité croisée. Dans ce cas, chaque anticorps secondaire spécifique à une espèce ne reconnaît qu’un seul type d’anticorps primaires. Les reporters fluorescents sont de petites molécules organiques, y compris des dérivés commerciaux, comme les colorants Alexa Fluor.

De nombreux modèles animaux sont utilisés pour comprendre des conditions physiologiques et pathologiques particulières. À ce jour, il est établi que de nombreuses voies métaboliques sont conservées au cours de l’évolution. Par conséquent, les études du CIS dans des organismes modèles tels que le poisson zèbre peuvent fournir un aperçu de la genèse et du maintien des conditions pathologiques et non pathologiques¹⁷. C’est un but de ce rapport pour illustrer des protocoles d’IHC qui peuvent être exécutés sur le tissu adulte de poisson zèbre et employés pour obtenir des images détaillées de la distribution et de la localisation d’OXA, d’OX-2R, et de CB1R aux niveaux périphériques et centraux. On signale également des protocoles pour l’application de deux principales méthodes indirectes du CIS dans les tissus périphériques et centraux du poisson zèbre adulte. La méthode indirecte, qui permet l’amplification du signal dans les cas où un anticorps secondaire est conjugué à un colorant fluorescent (méthode d’immunofluorescence) ou à un reporter enzymatique (méthode d’immunoperoxidase). Les méthodes de détection chromogéniques et fluorescentes possèdent des avantages et des inconvénients. Rapporté dans ce protocole est l’utilisation de IHC, principalement l’immunofluorescence, chez le poisson zèbre adulte, un modèle animal largement utilisé pour étudier les systèmes qui sont évolutifs conservés à travers différentes conditions physiologiques et pathologiques.