Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Immunohistochemistry (IHC) ist eine etablierte klassische Technik zur Identifizierung von Zell- oder Gewebekomponenten (Antigene) durch Antigen-Antikörper-Interaktion^1,2. Es kann verwendet werden, um die Lokalisierung und Verteilung von Zielbiomolekülen innerhalb eines Gewebes zu identifizieren. IHC verwendet immunologische und chemische Reaktionen, um Antigene in Gewebeabschnitten³zu erkennen. Die wichtigsten Marker, die für die Visualisierung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen verwendet werden, sind Fluoreszenzfarbstoffe (Immunfluoreszenz) und Enzym-Substrat-Farbreaktionen (Immunoperoxidase), die beide mit Antikörpern konjugiert sind⁴. Mittels mikroskopischer Beobachtung ist es möglich, die Lokalisation von markiertem Gewebe zu bestimmen, was in etwa der Lokalisation des Zielantigens im Gewebe entspricht.

Es gibt zwei Methoden für fluoreszierende oder chromogene Reaktionen zum Nachweis von Proteinen: die direkte Detektionsmethode, bei der der spezifische Primärantikörper direkt gekennzeichnet ist; und die indirekte Detektionsmethode, bei der der primäre Antikörper unkonjugiert wird, während der sekundäre Antikörper das Etikett^5,6,7trägt. Die indirekte Methode hat einige Vorteile, die vor allem ihre Signalverstärkung ist. Darüber hinaus ist es im Gegensatz zu anderen molekularen und zellulären Techniken mit Immunfluoreszenz möglich, die Verteilung, Lokalisierung und Koexpression von zwei oder mehr Proteinen, die in Zellen und Geweben differenziell exprimiert werden, zu visualisieren⁷. Die Wahl der verwendeten Erkennungsmethode hängt von experimentellen Details ab.

Bis heute ist IHC in der Grundlagenforschung als ein leistungsfähiges und wesentliches Werkzeug zum Verständnis der Verteilung und Lokalisierung von Biomarkern und der allgemeinen Profilierung verschiedener Proteine im biologischen Gewebe vom Menschen bis zu den wirbellosen Tieren 8^{, 9 , 10 , 11}. Die Technik hilft, eine Karte der Proteinexpression in einer großen Anzahl von normalen und veränderten tierischen Organen und verschiedenen Gewebetypen anzuzeigen, was eine mögliche Down- oder Up-Regulierung der Expression zeigt, die durch physiologische und pathologische Veränderungen induziert wird. IHC ist eine hochsensible Technik, die Genauigkeit und die richtige Wahl der Methoden erfordert, um optimale Ergebnisse zu erzielen¹². Zuallererst können viele verschiedene Faktoren wie Fixierung, Kreuzreaktivität, Antigenabruf und Empfindlichkeit von Antikörpern zu falsch positiven und falsch negativen Signalen führen¹³. Die Auswahl der Antikörper ist einer der wichtigsten Schritte in IHC und hängt von der Antigenspezifität und ihrer Affinität zu dem untersuchten Protein und den untersuchten Arten^{ab 7}.

Kürzlich haben wir die IHC-Technik optimiert, um Mitglieder von Orexin/Hypocretin- und Endocannabinoidsystemen in erwachsenem Zebrafischgewebe zu erkennen. Wir haben uns hauptsächlich auf Fixierung, Gewebeeinbettung mit zwei verschiedenen Ansätzen konzentriert, Schnitt und Montage (die Auflösung und Detail während der mikroskopischen Analyse beeinflussen können), und Blockierung (um falsch positive Positivmeldungen zu verhindern und Hintergrund zu reduzieren)¹⁴. Weitere wichtige Merkmale sind die Antikörperspezifität und Selektivität und Reproduzierbarkeit einzelner IHC-Protokolle. Der Schlüssel zur Bereitstellung von Antikörperspezifität ist die Verwendung von Negativkontrollen (einschließlich aller primären Antikörper oder Gewebe, von denen bekannt ist, dass sie die Zielproteine nicht ausdrücken) sowie positiver Kontrollen (einschließlich Gewebe, das bekanntermaßen die Zielproteine ausdrückt)¹⁵ . Die Auswahl von Antikörpern für IHC erfolgt auf der Grundlage ihrer Artenspezifität (die Wahrscheinlichkeit, mit der sie mit dem Antigen von Interesse reagieren) und den Antigen-Antikörper-Bindungsdetektionssystemen, die verwendet werden^{4,5,6 ,7}. Bei Der Immunperoxidase wird die Farbe der Reaktion durch die Auswahl des niederschlagsbestimmenden Chromogens, in der Regel Diaminobenzidin (braun)¹⁶bestimmt. Auf der anderen Seite nutzt immunofluoreszenz Antikörper, die mit einem Fluorophor konjugiert sind, um die Proteinexpression in gefrorenen Gewebeabschnitten zu visualisieren und ermöglicht eine einfache Analyse mehrerer Proteine in Bezug auf das chromogene Detektionssystem. ^{5 , 7}.

In der Immunoperoxidase-Technik wird der sekundäre Antikörper mit Biotin konjugiert, einem Linkermolekül, das in der Lage ist, ein chromogenes Reportermolekül [Avidin-Biotin-Komplex (ABC)] zu rekrutieren, was zur Verstärkung des Färbesignals führt. Mit der ABC-Reportermethode reagiert das Enzym Peroxidase mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) und erzeugt eine intensiv braun gefärbte Färbung, bei der das Enzym an den Sekundärantikörper bindet, der dann mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop analysiert werden kann. ABC-Färbung, aufgrund der hohen Affinität von Avidin für Biotin, produziert eine schnelle und optimale Reaktion, mit wenigen sekundären Antikörpern an der Stelle der primären Antikörperreaktivität befestigt. Diese chromogene Detektionsmethode ermöglicht die densitometrische Analyse des Signals und liefert semiquantitative Daten, die auf der Korrelation brauner Signalniveaus mit den Proteinexpressionsstufen¹⁸basieren.

Mit Immunfluoreszenz-Techniken ist der gleichzeitige Nachweis mehrerer Proteine aufgrund der Fähigkeit verschiedener Fluorchrome möglich, Licht bei einzigartigen Wellenlängen auszusenden, ist jedoch wichtig, Fluorchrome sorgfältig zu wählen, um spektrale Überlappungen ^{zu minimieren. 5}. Darüber hinaus minimiert die Verwendung primärer Antikörper bei verschiedenen Wirtsarten Schwierigkeiten bei der Kreuzreaktivität. In diesem Fall erkennt jeder artspezifische sekundäre Antikörper nur einen Primärantikörpertyp. Fluoreszierende Reporter sind kleine organische Moleküle, einschließlich kommerzieller Derivate, wie Alexa FluorFarbstoffe.

Viele Tiermodelle werden verwendet, um bestimmte physiologische und pathologische Bedingungen zu verstehen. Bis heute ist fest, dass viele Stoffwechselwege im Laufe der Evolution konserviert werden. Daher können IHC-Studien an Modellorganismen wie Zebrafischen Einblicke in die Entstehung und Aufrechterhaltung pathologischer und nichtpathologischer Erkrankungen geben¹⁷. Ziel dieses Berichts ist es, IHC-Protokolle zu veranschaulichen, die auf erwachsenem Zebrafischgewebe durchgeführt werden können und verwendet werden, um detaillierte Bilder der Verteilung und Lokalisierung von OXA, OX-2R und CB1R auf peripherer und zentraler Ebene zu erhalten. Ebenfalls berichtet sind Protokolle für die Anwendung von zwei wichtigen iHC indirekten Methoden in peripheren und zentralen Geweben von erwachsenen Zebrafischen. Beschrieben wird die indirekte Methode, die eine Signalverstärkung in Fällen ermöglicht, in denen ein sekundärer Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Immunfluoreszenzmethode) oder Enzymreporter (Immunoperoxidase-Methode) konjugiert wird. Sowohl chromogene als auch fluoreszierende Detektionsmethoden haben Vor- und Nachteile. In diesem Protokoll wird berichtet, dass IHC, hauptsächlich Immunfluoreszenz, bei erwachsenen Zebrafischen verwendet wird, ein Tiermodell, das weit verbreitet ist, um Systeme zu untersuchen, die evolutionär unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen konserviert werden.