Выявление ортексин и эндоканнабиноидных рецепторов у взрослых зебрафиш с использованием иммунопероксидаза и иммунофлуоресценции Методы

Иммуногистохимия (IHC) является устоявшейся классический метод, используемый для выявления клеточных или тканевых компонентов (антигенов) антиген-антитела взаимодействия^1,2. Он может быть использован для определения локализации и распределения целевых биомолекул в ткани. IHC использует иммунологические и химические реакциидля обнаружения антигенов в разделах тканей 3. Основными маркерами, используемыми для визуализации антиген-антител взаимодействия включают флуоресцентные красители (иммунофлуоресценция) и фермент-субстрат цветовых реакций (иммунопероксидаза), как сопряжены с антителами⁴. С помощью микроскопического наблюдения можно определить локализацию маркированной ткани, что примерно соответствует локализации целевого антигена в ткани.

Существуют два метода флуоресцентных или хромогенных реакций для обнаружения белка: метод прямого обнаружения, в котором конкретное первичное антитело прямо помечено; и косвенный метод обнаружения, в котором первичное антитело неконъюгировано, в то время как вторичное антитело носит этикетку^5,6,7. Косвенный метод имеет некоторые преимущества, которые в основном его усиление сигнала. Кроме того, в отличие от других молекулярных и клеточных методов, с иммунофлуоресценцией, можно визуализироватьраспределение, локализацию и коэкспрессию двух или более белков, дифференциально выраженных в клетках и тканях 7. Выбор используемого метода обнаружения зависит от экспериментальных деталей.

На сегодняшний день IHC широко используется в фундаментальных исследованиях как мощный и важный инструмент для понимания распределения и локализации биомаркеров и общего профилирования различных белков в биологических тканях от человека до беспозвоночных^{8, 9 До 9 , 10} Лет ^{, 11}. Техника помогает отображать карту экспрессии белка в большом количестве нормальных и измененных органов животных и различных типов тканей, показывая возможное вниз или вверх-регуляции экспрессии индуцированных физиологических и патологических изменений. IHC является высокочувствительным методом, который требует точности и правильного выбора методов для получения оптимальных результатов^12. Прежде всего, многие различные факторы, такие как фиксация, кросс-реактивность, извлечение антигена и чувствительность антител могут привести к ложноположительным и ложным негативным сигналам^13. Выбор антител является одним из наиболее важных шагов в IHC и зависит от антигена специфичность и его сродство к белка и видов под следствием⁷.

Недавно мы оптимизировали метод IHC для обнаружения членов орексина/гипокретина и эндоканнабиноидов во взрослой ткани зебры. Мы сосредоточились главным образом на фиксации, встраивание тканей с использованием двух различных подходов, секции и монтажа (которые могут повлиять на разрешение и детализацию во время микроскопического анализа), а также блокирование (для предотвращения ложных срабатываний и уменьшения фона)¹⁴. Другими важными характеристиками являются специфика антител и избирательность и воспроизводимость отдельных протоколов IHC. Ключом к обеспечению специфики антител является использование отрицательного контроля (в том числе никаких первичных антител или тканей, которые, как известно, не выражают целевых белков), а также положительный контроль (в том числе ткани, которая, как известно, выражают целевые белки)¹⁵ . Выбор антител для IHC производится на основе их видовой специфичности (вероятность того, что они реагируют с антигеном интереса) и антиген-антитела связывающих систем обнаружения, который используется^{4,5,6 ,7}. В случае иммунопероксидазы цвет реакции определяется отбором осажденного хромогена, обычно диаминобензидина (коричневого)^16. С другой стороны, яmmunofluorescence использует антитела, конъюгированные с фторфором, чтобы визуализировать экспрессию белка в замороженных секциях тканей и позволяет легко анализировать несколько белков по отношению к системе обнаружения хромогенных ^{5 , 7}.

В методе иммунопероксидазы вторичное антитело спрягается с биотином, молекулой связующего, способной завербовать хромогенную молекулу репортера (Avidin-biotin complex (ABC) “, что приводит к усилению сигнала окрашивания. С помощью метода репортера ABC, фермент пероксидазы реагирует с 3,3′-диаминобензидин (DAB), производя интенсивно коричневого цвета окрашивания, где фермент связывается со вторичным антителом, которые затем могут быть проанализированы с обычным световым микроскопом. ABC окрашивания, из-за высокой сродство авидина для биотина, производит быструю и оптимальную реакцию, с несколькими вторичными антителами прилагается к месту первичной реактивности антитела. Этот хромогенный метод обнаружения позволяет денситометрический анализ сигнала, обеспечивая полуколичественные данные на основе корреляции уровня коричневого сигнала с уровнями экспрессии белка^18.

С иммунофлюоресценции методы, одновременное обнаружение нескольких белков возможно из-за способности различных флюорохромов излучать свет на уникальных длинах волн, но важно тщательно выбирать фторхромы, чтобы свести к минимуму спектральные перекрытия ⁵. Кроме того, использование первичных антител у различных видов хозяев сводит к минимуму трудности, связанные с перекрестной реактивностью. В этом случае каждый специфический вид вторичных антител распознает только один тип первичных антител. Флуоресцентные репортеры представляют собой небольшие органические молекулы, в том числе коммерческие производные, такие как красители Alexa Fluor.

Многие модели животных используются для понимания конкретных физиологических и патологических состояний. На сегодняшний день установлено, что многие метаболические пути сохраняются в течение эволюции. Таким образом, IHC исследований в модельных организмов, таких как зебрафиш может обеспечить понимание генезиса и поддержания патологических и непатологических условий¹⁷. Целью настоящего доклада является иллюстрация протоколов IHC, которые могут быть выполнены на ткани взрослых зебры и использованы для получения подробных изображений распределения и локализации OXA, OX-2R и CB1R на периферийных и центральных уровнях. Также сообщается о протоколах применения двух основных косвенных методов IHC в периферических и центральных тканях взрослых зебр. Описанный является косвенным методом, который позволяет усиливать сигнал в тех случаях, когда вторичное антитело спрягается с флуоресцентным красителем (метод иммунофлуоресценции) или ферментным репортером (метод иммунопероксидазы). Как хромогенные, так и флуоресцентные методы обнаружения обладают преимуществами и недостатками. В этом протоколе сообщается об использовании IHC, главным образом иммунофлуоресценции, у взрослых зебр, модели животных, широко используемой для изучения систем, которые эволюционно сохраняются в различных физиологических и патологических условиях.