I dette arbeidet presenteres en protokoll for signal forsterkning av nanoprobe-baserte biosensing. Protokollen er basert på reduksjon av chloroauric syre på overflaten av eksisterende nanoprobes som består av gull, sølv, silica eller jernoksid nanopartikler.
Bruk av nanoprobes som gull, sølv, silica eller jernoksid nanopartikler som gjenkjenning reagenser i bioanalytical analyser kan aktivere høy følsomhet og praktisk kolorimetrisk avlesning. Imidlertid er høye tettheter av nanopartikler vanligvis nødvendig for gjenkjenning. Tilgjengelige syntese-baserte ekstrautstyr protokollene er enten gull og sølv nanopartikler eller stole på nøyaktig enzymatisk kontroll og optimalisering. Her presenterer vi en protokoll for å forbedre den kolorimetrisk avlesning av gull, sølv, silica og jernoksid nanoprobes. Det ble observert at kolorimetrisk signalet kan forbedres ved inntil en 10000-fold faktor. Grunnlaget for slike signal forsterkning strategier er kjemisk reduksjon av Au3 + Au0. Det er flere kjemiske reaksjoner at reduksjon av Au3 + Au0. Gods buffere og H2O2 brukes i protokollen, og det er mulig å favorisere avsetning Au0 på overflaten av eksisterende nanoprobes, i skade for dannelsen av nye gull nanopartikler. Protokollen består av inkubasjonstiden for microarray med en løsning med chloroauric syre og H2O2 i 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre pH 6 bufferen etter nanoprobe-basert oppdagelsen analysen. Løsningen kan brukes til papir og glass-baserte sensorer. Dessuten kan det brukes i kommersielt tilgjengelig immunanalyser som demonstrert av anvendelsen av metoden til en kommersiell allergen microarray. Signalet utvikling krever mindre enn 5 min med inkubering med ekstrautstyr løsningen og er avlesning kan bli vurdert av blotte øye eller low-end bilde oppkjøpet enheter som en bord-skanner eller et digitalt kamera.
Bruk av nanomaterialer som gull nanopartikler (AuNPs) eller jernoksid nanopartikler (IONPs) har tillatt programmene i biosensing med økt følsomhet og allsidighet. 1 mengde metoder utviklet for utsmykkingen av overflaten av nanopartikler med forskjellige stoffer i kroppen, som å dra nytte av deres høy overflate til volumkontrollen, har aktivert utformingen av sensorer med økt følsomhet. 2 likevel en biosensing verktøyet er avhengig av antall nanoprobes som kreves for å oppnå en detectable signal. For eksempel ved 40 nm AuNPs, å skaffe seg et signal gjennom UV-vis spektroskopi, ca 90 × 106 nanoprobes kreves for å effektivt oppdage mål av interesse. 3 denne nanoprobe tetthet begrensningen kan omgås ved hjelp av signalforsterkning. Slike strategier4 kan baseres på interparticle samling eller agglomeration, der tettheten av første nanoprobes økes med samler et annet sett med nanoprobes på først. 5 av nanopartikler på et bestemt sted på en sensor overflate gir visuelle eller UV-vis signalet vinningen. Imidlertid vil sensitiviteten av analysen bli iboende koblet målretting kapasiteten på det andre settet med nanopartikler mot den første settet med nanoprobes. Andre strategier er avhengige av den flekker av enten gull og sølv nanoprobes. 6 , 7 den flekker oppnås gjennom reduksjon av sølv ioner onto overflaten av nanopartikler, aktivere en visual eller UV-vis gjenkjenning. 8 metodene forbedre signalet av gull eller sølv nanoprobes av potentiating overflaten resonans plasmon signal, ikke avhengig av sekundær målretting hendelser som interparticle agglomeration metoder. Sølv flekker metoder har imidlertid bare rapportert med bruk av gull eller sølv nanoprobes. 8 , 9
I 2005, Zayats et al. 10 rapportert reduksjon av Au ioner onto overflaten av gull nanoprobes å øke overflaten plasmon resonans signalet. I dette enzymet-avhengige arbeidet, ble hydrogenperoksid generert av glukose oksidase katalyse og cetyltrimethylammonium chloride tillatt reduksjon av chloroauric syre.
Nylig Wang et al. rapportert en enhancement metode hvor et gull lag er produsert på overflaten av eksisterende nanoprobes. 11 disse forstørret nanoprobes vises peroxidase-lignende katalytisk aktivitet mot underlaget 3, 5, 5 ‘-tetramethylbenzidine (TMB) aktivere visualisering av lys blå farge ved å blotte øye.
Stevens et al. rapportert utviklingen av en plasmonic ELISA-baserte analysen. 12 etter oppdagelsen av en prostata-spesifikt antigen (PSA) gjennom en tradisjonell ELISA strategi, en sekundær antistoff merket med catalase ble inkubert med sensor som sensoren var oppslukt i en løsning som inneholder hydrogenperoksid og chloroauric syre. Tilstedeværelsen av sekundær catalase endret antistoffer (positivt resultat) ville fremme forbruket av Hydrogenperoksid, bremse chloroauric syre reduksjon og gir kvasi sfærisk monodispersed AuNPs med en rød farge. Fravær av catalase endret antistoffer (negativt resultat) tillatt hydrogenperoksid konsentrasjonen være intakt, dermed fremme rask chloroauric reduksjon og gir AuNPs med dårlig definerte morphologies ansvarlig for en blålilla farge . Konsentrasjonen av hydrogen peroxide, bestemmes av aktiviteten til catalase, viste seg å være korrelert til konsentrasjonen av analytt rundt. Behovet for en catalase endret sekundære antistoff og kontroll av betingelsene for katalytisk aktiviteten er to faktorer som hindrer universalitet av denne metoden. Videre kan dannelsen av gull klynger, uavhengig av den eksisterende AuNPs, introdusere bakgrunn støy problemer til forsterkning strategi.
De ovennevnte teknikkene, som også flere andre13,14,15, har gjort det mulig for nanoprobe-basert biosensors å oppnå grensene for gjenkjenning på linje med tradisjonelle teknikker.
Her, en roman gull enhancement metode er bevist, der signalet fra en eksisterende nanoprobe forsterkes av potentiating eller innføre en overflate plasmon resonans signal. Etter at registreringen er utført med bruk av gull, sølv, silica eller jernoksid nanopartikler, sensoren er tillatt å ruge med en løsning på en blanding av hydrogen peroxide og chloroauric syre i 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) pH 6 buffer. Konsentrasjonen av komponentene i løsningen var optimalisert for å favorisere avsetning Au0 på overflaten av eksisterende nanoprobes. For alle studert nanoprobe typer, dvs. AuNPs, silver nanopartikler (AgNPs), silica nanopartikler (SiNPs) og IONPs, dannelsen av en dårlig definerte lag gitt eller utvidet spredning av lys som resulterte i en synlig eller økt synlig signal. En signal økning med en 100-fold forsterkning faktor ble oppnådd for nanoprobes i papir og glass-basert microarrays og prosessen tar mindre enn 5 minutter å få et signal. Signalet vinningen kan gjøres av blotte øye, UV-vis spektroskopi eller imaging low-end verktøy som et digitalt kamera eller en bord-skanner. Videre ble det vist at denne ekstrautstyr protokollen kan lett brukes i en kommersielt tilgjengelig allergi diagnostiske analysen uten spesifikk optimalisering.
Foreløpig signal teknikker for analyser med nanoprobe-basert oppdagelsen er enten enzym-baserte12, krever et annet sett med nanopartikler mot oppdagelsen nanoprobes21 eller ved flekker teknikker, er begrenset til Bruk av AuNPs eller AgNPs som gjenkjenning sonder. 22 her, en enkel, rask og enzym-fri metode er beskrevet for signal forsterkning av nanoprobe detection-baserte analyser. Med denne metoden, var det mulig å forbedre kolorimetrisk signalet fra 4 typer nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs og SiNPs.
Den observerte forsterkning faktoren for hvert nanoprobes var 100-fold, bortsett fra SiNPs der kvantifisering av ekstrautstyr faktor ikke var mulig grunn av pre ekstrautstyr signaler. Denne forbedringen faktoren antyder at effektiviteten av protokollen ligner alle typer nanoprobes. Videre, når ekstrautstyr protokollen ble utført på en papirstøtten der en fortynning rekke en lager AuNPs suspensjon ble skrevet ut, det ble observert en 10000-fold forsterkning faktor. Forrige til ekstrautstyr, de synlige flekkene med det laveste antallet AuNPs var der ca 10000 nanopartikler ble trykt, ekstrautstyr flekker skjuler 10 nanopartikler ble synlig. 20
Betingelsene etablert for ekstrautstyr protokollen her presentert har tillatt utnytter reduksjon av Au3 + Au0 for signalet å forbedre, mens bakgrunnsstøy til et minimum. Forbedringen kan utføres rett etter analysen utføres samt på microarrays som har vært lagret i opptil flere måneder etter analysen ble utført. Løsningen består av en 1:1 blanding av løsning 1 og løsning 2. Begge løsninger kan tidligere blandet eller direkte blandet når pipetted på microarray. Forskjellen mellom pre blande eller direkte blande påvirker bare holdbarheten av ekstrautstyr løsningen. Når ferdigblandet holdbarheten er 5-7 dager øker til 30-45 dager hvis ikke pre blandet.
Videre analyse av resultatene har vist at metoden ekstrautstyr ikke forstyrrer kvantitativ analyse av biosensor. En lineær sammenheng mellom intensiteten observert og konsentrasjonen av analytt ble opprettholdt (tabell 1). Dataene innhentet for 4 pre preget klinisk prøver med glass-basert allergen komponent microarray immunanalyse, med standard fluorescens gjenkjenning og kolorimetrisk oppdagelsen, viste en god samsvar mellom de to gjenkjenning metodene. Sammenligne mener fluorescens intensiteten (MFI) og den betyr kolorimetrisk intensiteten (MCI), en gjennomsnittlig R2 = 0,79 +/-0,08 ble innhentet når dataene er 10-logget på begge aksene. Dette eksperimentet viste at forsterkning metoden kan brukes til en kommersiell pakke hvis det bruker nanoprobes for gjenkjenning eller kan tilpasses for nanoprobe-basert oppdagelsen.
Forsterkning metoden effekten er avhengig av to viktige aspekter. Det er viktig å sikre at blanding av løsning 1 og 2 er homogen. Uten en homogen blanding, vil sensoren være i kontakt med deler av løsningen der løsning 1 eller 2 er dominerende i forhold til den andre. Det vil redusere effektiviteten av reduksjon av Au3 + Au0, således skadelige effektiviteten av forbedringen. Det er også viktig å ha hele området av interesse microarray i kontakt med løsningen under inkubasjonstiden.
For å oppnå ultrasensitive forbedring av et signal, vil lengre inkubasjon tid (ca 5 min) med ekstrautstyr løsningen være nødvendig. For å unngå utvikling av bakgrunnsstøy som kan forstyrre signalet vinningen, bør microarray overflaten være tidligere blokkert (f.eks BSA, PEG) å hindre rask uspesifikke deponering av Au0 og påfølgende dannelsen av gull lag.
En begrensning for metoden ekstrautstyr er iboende effekten av analysen. Analysen krever å ha negative og positive kontroller for å sikre at signalet styrking observert kan tilskrives sann-positive resultater. Hvis det er en uspesifikk samspillet i nanoprobes med målet, signaler kjøpt etter ekstrautstyr ikke vil være gyldig.
Andre teknikker er basert på enten hydrogenion samlingen eller flekker av nanopartikler med et materiale som gir forbedret signalet vinningen. Ved å fremme samling av antall nanopartikler på webområdet gjenkjenning, signalet vinningen kan enten visuelt eller UV-Vis målenheter. 5 teknikker disse signal stole på en to-trinns deteksjon system, første påvisning av analytt renter og andre trinnet der reporteren er nødvendig for å binde til den første oppdagelse konstruere. Slike strategier mangler universalitet på behovet for bestemte ekstrautstyr protokollen optimalisering for hver analysen.
Farging ekstrautstyr teknikker, for eksempel sølv flekker, mye som protokollen her presenteres, tillater direkte styrking av signalet oppdagelsen konstruksjoner. Men i motsetning til protokollen som vises her, har sølv flekker bare vært vist på AuNPs eller AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
Anvendelsen av denne metoden kan trolig span alle analysen som bruker AuNPs, AgNPs, IONPs eller SiNPs som gjenkjenning. Videre arbeid blir utført for å studere anvendelsen av metoden sensorer som består av andre materialer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant avtalen nr. 615458, svensk forskningsråd og Pronova excellence center for protein teknologi (VINNOVA – svensk Direktorat for innovasjon systemer) er takknemlig anerkjent.
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |