原金ナノ粒子合成による急速なナノプローブ信号強調

ひと血清サンプルのコレクション、すなわち国の法的および倫理的な要件に基づき得られました。倫理委員会の (または類似の) 承認とドナーから書面による同意。 1. 強化ソリューションの準備: 脱イオン水でナトリウム塩 MES を中断することにより 10 mM MES pH 6 バッファーを準備します。6 4 M NaOH 溶液を使用するために pH を調整します。 5 mM 10 mM MES 6 pH 緩衝 (ソリューション 1) HAuCl4ソリューションを準備します。 10 mM MES 6 pH 緩衝 (解決方法 2) 1.027 M H2O2ソリューションを準備します。注: 解決方法 1 と解決方法 2 のボリュームは強化される数とマイクロ アレイのサイズに依存します。たとえば、10 × 10 mm のマイクロ アレイは、100 μ L 容量 (ソリューション 1 + 解決策 2) に確実に強化ソリューションと接触してマイクロ アレイ領域を必要です。後希釈、約 30-45 日以内の H2O2が使わなければなりません。 2. ナノ粒子作製: 準備 40 nm の金ナノ粒子 Bastúsらで説明されているようです。16簡潔に、2.2 mM クエン酸ナトリウム (149 の mL) の沸騰溶液 1 mL の水溶液の 25 mM HAuCl4前駆体を注入します。赤ワイン色が観察されるまで待機します。種子成長ステップの種子としてナノ粒子のこのソリューションを使用します。 90 ° C での種子を含む液に 25 mM HAuCl4の 1 mL に続いて 60 mM クエン酸ナトリウム 1 mL を注入します。30 分後反応は完了です。種子の生長まで手順を繰り返します 5 回 40 nm のナノ粒子が得られる、Bastúsらによる記述で。16 ナノ粒子ナノ粒子のサイズを決定するための最終的な解決の紫外可視吸光度を測定します。17また、透過電子顕微鏡 (TEM) を取得して使用できるナノ粒子のサイズを決定します。 準備 90 nm AgNPs リベロらで説明されているようです。18は簡潔に、ポリ (アクリル酸ナトリウム) の積極的に撹拌した溶液に dimethylaminoborane (と) を追加 (PAA)、アグノ3。ソリューションの最終巻、50 mL と、PAA の最終的な集中とアグノ3それぞれ 1.6 mM、10 mM と 3.33 mM。注: カルボキシル基と 50 変更 100 nm IONPs nm のカルボキシル基修飾 SiNPs を購入しました。 抗体プエルタスらによって記述されたプロトコルに従うと、金ナノ粒子を付着させる目的します。19は簡単に言えば、1.2×10-9 M 金ナノ粒子溶液に COOH-ペグ-SH (5000 g·mol− 1) の 1 mg を追加 (OD 10 光密度)。12 4 M の NaOH 溶液で pH を調整します。 穏やかな攪拌条件室温 (~ 22 ° C) で一晩インキュベート ソリューションをしましょう。 ペグの過剰を削除するには、15 分間 13800 x g でソリューションを遠心分離します。 500 μ L の脱イオン水でペレットを再懸濁します。 N–(3-Dimethylaminopropyl) – n 5 μmol と PEG 修飾金ナノ粒子を孵化させなさい ‘-ethylcarbodiimide 塩酸塩 (EDC) と 10 mM MES ph 6 N hydroxysulfosuccinimide ナトリウム塩 (スルホ-NHS) 7.5 μmol 37 ° C で 30 分のバッファー EDC とスルホ NHS の過剰を削除するには、5 分 13800 x g で溶液を遠心分離します。 500 μ L の 10 mM MES pH 6 バッファーでペレットを再懸濁します、抗体の 100 g·mL-1を追加します。解決策は 37 ° C で 2 時間インキュベートみましょう 10 分間 13800 x g でソリューションを 2 回遠心分離によって抗体の過剰を削除し、500 μ L の 10 mM リン酸ナトリウム pH 7.5、0.3 M NaCl バッファーでペレットを再懸濁します。解決策は 37 ° C で 30 分間インキュベートみましょう 2 回 10 分間 13800 x g でソリューションを遠心分離によって非特異的結合抗体を削除し、10 mM MES pH 6 バッファーで 500 μ L の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) でペレットを再懸濁します。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします。 2 回、10 分間 13800 x g でソリューションを遠心分離して 500 μ L の 10 mM MES pH 6 バッファーでペレットを再 BSA の過剰を洗います。 EDC とスルホ NHS の量を適宜調整する抗体 SiNPs の 5 M AgNPs、IONPS の 0.5 mg、0.5 mg の変更用アドレスは、2.5.9 を 2.5.1 手順に従います。 3. 垂直流紙ベース試金: マイクロ アレイを準備するには、ロボットのプリンターとニトロセルロース紙膜タンパク質 G 濃度勾配を入金します。印刷した後、室温 (~ 22 ° C) でマイクロ アレイ一晩乾燥をしましょう。 フィルター ホルダーで囲まれた膜の垂直方向の流れの試金を遂行します。1 mL·min− 1の割合で超シリンジ ポンプを使用して igg 抗体修飾金ナノ粒子の 8 M ソリューションを流れ。17 M IgG 変更 AgNPs のソリューションでこの手順を繰り返します 0.1 mg·mL− 1 IgG 変更 SiNPs と 0.1 mg·mL− 1 IgG 変更 IONPs。 マイクロ アレイは室温 (~ 22 ° C) で 30 分間乾燥し、4800 dpi の解像度でフラット ベッド スキャナーでスキャンができます。24 ビット カラーの TIFF ファイルとしてイメージを保存します。 4. 商業ガラス ベースのアッセイを参照します。 120 分室温で 4 の異なる血清サンプルでアレルゲン成分検出のための 2 つのガラス スライドを孵化させなさい。 脱イオン水でマイクロ アレイをすすいでください。 加温 30 分抗ひと IgE と 2 番目のスライド加温室温 (~ 22 ° C) での蛍光標識抗ひと IgE 抗体と 1 つのスライド抗体修飾金ナノ粒子室温で 30 分間。 脱イオン水でマイクロ アレイをすすいでください。 レーザースキャニング装置と蛍光抗ひと IgE 抗体とインキュベートされたマイクロ アレイの蛍光強度を測定します。比色信号集録の卓上スキャナーで抗体修飾金ナノ粒子抗ひと IgE と培養されたマイクロ アレイをデジタル化します。 デジタル化後、5 分間室温 (~ 22 ° C) で強化ソリューションとマイクロ アレイをインキュベートします。 脱イオン水でセンサーを洗浄、室温 (~ 22 ° C) で 10 分間乾燥するようにし、なさい。 マイクロ アレイを比色信号集録の 4800 dpi の解像度でテーブル トップのスキャナーでデジタル化します。16 ビット グレースケール TIFF ファイルの画像を保存します。 5. マイクロ アレイ培養強化ソリューション: 事前解決方法 1 と解決方法 2 の同じ量を混合またはセンサーの表面に直接それらをミックスし、マイクロ アレイに関心のある分野が溶液の混合物で覆われていることを確認します。 Let センサーを 5 分長い孵化に時間得ることができる特に紙ベースのマイクロ アレイのための高い信号/ノイズ比と同様、改良された感度の強化ソリューション室温で孵化させなさい。 5 回の脱イオン水に水没してマイクロ アレイを洗い米のまま室温で乾燥します。注: 乾燥段階の時間は、マイクロ アレイの素材によって異なります。紙ベースのマイクロ アレイの乾燥段階には約 30 分が必要です。ガラス製マイクロ アレイ乾燥約 5-10 分が必要です。 6. イメージングによる解析: ソフトウェア ツールで蛍光強度を分析します。センサーの製造元の使用 (DfU) の指示に従って 0.3 Isac 標準化ユニット (ISU) 以上は、すべての結果を検討してください。 ソフトウェア ツールを使用して色の強度を分析します。画像ファイルを反転、各スポットの光強度を測定し、平均輝度を計算します。帳票のスポットの値を使用して、3 つの平均スポット ピクセル強度の平均として最終的な信号値を計算します。