בעבודה זו, מוצג עבור שיפור האות של biosensing nanoprobe מבוססי פרוטוקול. הפרוטוקול מבוסס על ההפחתה של חומצה chloroauric על פני nanoprobes הקיים המורכבים של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל.
השימוש nanoprobes כגון זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל כמו ריאגנטים זיהוי במבחני וביו-אנליטיות וואלידציה יכול לאפשר רגישות גבוהה ולא נוחה readout ערכי צבע מוחלטים. עם זאת, צפיפות גבוהה של חלקיקים נדרשים בדרך כלל עבור זיהוי. הפרוטוקולים זמינים שיפור מבוסס-סינתזה או חלקיקים מוגבל של כסף וזהב, או להסתמך על שליטה מדויקת אנזימטי ואופטימיזציה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את המדידה ערכי צבע מוחלטים של זהב, כסף, סיליקה, תחמוצת ברזל nanoprobes. זה היה ציין כי האות ערכי צבע מוחלטים יכולים להשתפר על ידי עד גורם 10000-fold. הבסיס לאסטרטגיה שיפור כזה האות הוא צמצום הכימי Au3 + Au0. ישנם מספר תגובות כימיות המאפשרים צמצום Au3 + Au0. בפרוטוקול, יכולות buffers ו- H2O2 משמשים ויש אפשרות להעדיף בתצהיר של Au0 על פני nanoprobes הקיימים, ב לרעת של היווצרות של חלקיקי זהב חדש. הפרוטוקול מורכב הדגירה של microarray פתרון בהיקף של חומצה chloroauric ו- H2O2 ב 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה pH 6 מאגר בעקבות וזמינותו זיהוי מבוסס nanoprobe. ניתן להחיל את הפתרון שיפור נייר וחיישנים מבוססי זכוכית. יתר על כן, זה יכול לשמש immunoassays זמינים מסחרית כפי שמתואר על-ידי היישום של השיטה כדי microarray אלרגן המסחרי. התפתחות האות דורש פחות מ 5 דקות של דגירה עם הפתרון שיפור, המדידה יכול להיות מוערך על ידי בעין או התקנים רכישת התמונה זולים כמו סורק שולחני או מצלמה דיגיטלית.
השימוש של ננו-חומרים, כמו חלקיקי זהב (AuNPs) או חלקיקי תחמוצת ברזל (IONPs) אפשרה את היישומים ב- biosensing עם רגישות משופרים ורב-תכליתיות. 1 שפע של שיטות שפותחו עבור הקישוט של פני השטח של חלקיקים עם ליגנדים שונים, כדי לנצל את פני השטח גבוהה שלהם יחס נפח, אפשרו את העיצוב של חיישנים עם רגישות משופרת. 2 . עם זאת, כלי biosensing הוא תלוי מספר nanoprobes הדרוש להשגת אות לזיהוי. לדוגמה, במקרה של 40 ננומטר AuNPs, לרכוש אות באמצעות UV-vis ספקטרוסקופיה, כ nanoprobes6 × 10 90 נדרש כדי לזהות ביעילות ביעד של ריבית. 3 מגבלה זו צפיפות nanoprobe יכול שיפרו באמצעות הגברה של האות. אסטרטגיות כאלה4 יכול להתבסס על צבירת interparticle או הצטברות, שבו הצפיפות של nanoprobes הראשונית מתגברת על ידי צבירת קבוצה שנייה של nanoprobes השני. 5 הגדלת מספר חלקיקים במיקום נתון על משטח החיישן מאפשר חזותי או UV מול האות רכישה. עם זאת, הרגישות של וזמינותו תקושר מטבעו בהתאם לקיבולת מיקוד של הסט השני של חלקיקים כלפי הקבוצה הראשונית של nanoprobes. אסטרטגיות אחרות להסתמך על ההכתמה של nanoprobes או זהב וכסף. 6 , 7 ההכתמה מושגת באמצעות הפחתה בצריכת יוני כסף על גבי המשטח של חלקיקים, הפעלת של visual או לזיהוי UV-vis. 8 בשיטות אלה להגביר את האות של הקיים זהב או כסף nanoprobes על ידי potentiating פלזמון תהודה משטח את האות, לא בהתאם משני אירועים מיקוד כמו הצטברות interparticle שיטות. עם זאת, שיטות מכתימים כסף רק דווחו עם השימוש nanoprobes זהב או כסף. 8 , 9
בשנת 2005, Zayats et al. 10 דיווח ההפחתה של Au יונים על פני nanoprobes זהב כדי להגביר את האות תהודה פלזמון משטח. בעבודה זו תלויי-אנזים, מימן על-חמצני נוצר על ידי גלוקוז אוקסידאז זרז, יחד עם cetyltrimethylammonium כלוריד מותר ההפחתה של חומצה chloroauric.
לאחרונה וואנג ואח. דיווח על שיטת שיפור שבו נוצרת שכבת זהב על פני השטח של nanoprobes הקיים. 11 nanoprobes מוגדלת אלה מוצגים peroxidase כמו פעילות קטליטית נגד המצע 3′, 5, יונקות-tetramethylbenzidine (שוייץ) המאפשר את החזיית צבע כחול בהיר בעין בלתי מזוינת.
סטיבנס. et al. דיווח על התפתחות plasmonic assay מבוסס-אליסה. 12 לאחר זיהוי אנטיגן ספציפי הערמונית (PSA) באמצעות אסטרטגיה אליסה המסורתית, נוגדנים משניים המסומנת קטלאז, נדגרה בעזרת חיישן אחרי אשר החיישן היה שקוע פתרון המכיל מימן על-חמצני, חומצה chloroauric. הנוכחות של משני קטלאז-לאחרונה הנוגדן (תוצאה חיובית) תקדם את צריכת חמצן, מאט הפחתת חומצה chloroauric, מניב מעין כדורית monodispersed AuNPs עם צבע אדום. העדר של הנוגדן קטלאז-לאחרונה (תוצאה שלילית) אפשרה את ריכוז חמצן ללא פגע, ובכך לקדם את ההפחתה chloroauric מהירה, מניב AuNPs עם האחראי על צבע כחול/סגול ברורות וההקשר מורפולוגיות . ריכוז חמצן, נקבע על ידי פעילות קטלאז, הוצגה בקורלציה לריכוז analyte עניין. הצורך של נוגדנים משניים קטלאז-לאחרונה, השליטה של התנאים של פעילות קטליטית הם שני הגורמים המעכבים את האוניברסליות של שיטה זו. יתר על כן, היווצרות של אשכולות זהב, באופן עצמאי AuNPs קיימים, עשויים להציג נושאים רקע רעש את האסטרטגיה הגברה.
הטכניקות הנ ל, כמו גם כמה אחרים13,14,15, שהפכו עבור ביולוגיים מבוססי nanoprobe להשיג את הגבולות של זיהוי שוה עם טכניקות מסורתיות.
כאן, שיטה שיפור זהב הרומן הוא הפגין, איפה האות של nanoprobe הקיים מוגבר על-ידי שמגדיל יכולתו או היכרות עם אות תהודה פלזמון משטח. לאחר הזיהוי מתבצעת עם השימוש של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל, החיישן מותר דגירה עם פתרון של תערובת של מימן על-חמצני וחומצה chloroauric ב 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic (MES) חומצה pH 6 מאגר. הריכוזים של הרכיבים השונים הפתרון שיפור אופטימציה לטובת בתצהיר של Au0 על פני השטח של nanoprobes הקיים. עבור כל למד nanoprobe סוגי, כלומר. AuNPs, סילבר חלקיקים (AgNPs), חלקיקי סיליקה (SiNPs), IONPs, היווצרות רובד ברורות וההקשר הניב או augmented הפיזור של האור אשר הביא אות גלוי לזיהוי או מוגבר. עלייה אות עם גורם הגברה 100-fold הושג nanoprobes נייר, זכוכית מבוסס מיקרו-מערכים, התהליך לוקח פחות מ 5 דקות כדי לרכוש אות. רכישת אות יכול להיעשות על ידי בעין בלתי מזוינת, UV-vis ספקטרוסקופיה או הדמיה כלים זולים כגון מצלמה דיגיטלית או סורק שולחני. יתר על כן, הוכח כי פרוטוקול שיפור זה ניתן בקלות ליישם assay אבחון אלרגיה זמינים מסחרית ללא צורך אופטימיזציה ספציפיים.
כיום, טכניקות שיפור האות מבחני עם זיהוי מבוסס nanoprobe או מבוססי אנזים12, דורשים קבוצה שנייה של חלקיקים למטרה nanoprobes זיהוי21 , או, במקרה של צביעת טכניקות, מוגבלים ל השימוש AuNPs או AgNPs כמו זיהוי הגששים. 22 . כאן, שיטה פשוטה, מהירה ונטולת אנזים מתואר עבור שיפור האות של מבחני זיהוי מבוסס nanoprobe. בשיטה זו, ניתן היה לשפר את האות ערכי צבע מוחלטים שסופקו על-ידי 4 סוגים של nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs ו- SiNPs.
הגורם הגברה שנצפו עבור כל ערכה של nanoprobes היה של 100-fold, למעט SiNPs שבו כימות של הגורם שיפור איננה אפשרית עקב חוסר שיפור קדם אותות. גורם שיפור זה מרמז כי היעילות של הפרוטוקול דומה בין כל סוגי nanoprobes. יתר על כן, כאשר פרוטוקול שיפור בוצעה על תמיכה נייר שבו הודפס סדרה דילול של השעיה AuNPs מניות, זה נצפתה גורם הגברה 10000-fold. הקודם כדי שיפור, המקומות גלוי עם המספר הנמוך ביותר של AuNPs היו בו הודפסו כ 10000 חלקיקים, לאחר שיפור המקומות הסתרת חלקיקים פחות מ- 10 הפך גלוי. 20
התנאים הוקמה עבור פרוטוקול שיפור שהוצגו כאן אפשרו ניצול של צמצום Au3 + Au0 לשיפור אותות, תוך שמירה על רעשי הרקע למינימום. ניתן לבצע השיפור אחרי וזמינותו מתבצע כמו גם על מיקרו-מערכים זה שהם אוחסנו עבור עד מספר חודשים לאחר וזמינותו בוצעה. הפתרון שיפור מורכבת תערובת 1:1 של פתרון 1 פתרון 2. שני פתרונות שניתן בעבר מעורב או מעורב ישירות כאשר pipetted על גבי microarray. ההבדל בין ערבוב מראש או ערבוב ישיר משפיע רק משך חיי המדף של הפתרון שיפור. כאשר טרום מעורב משך חיי המדף של 5-7 ימים גדל ל 30-45 ימים אם לא טרום מעורב.
ניתוח נוסף של התוצאות הראו כי שיטת שיפור אינה מפריעה ניתוח כמותי של החיישן. מתאם ליניארי בין עוצמת נצפתה ריכוז analyte היה מתוחזק (טבלה 1). הנתונים שהתקבלו עבור 4 דגימות קליניים מאופיין מראש באמצעות מתכלה microarray רכיב של אלרגן המבוסס על זכוכית, עם קרינה פלואורסצנטית רגילה איתור וזיהוי ערכי צבע מוחלטים, הראה קונקורדנציה טוב בין שתי השיטות לזיהוי. להשוות את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) ואת עוצמת ערכי צבע מוחלטים רשע (MCI), ממוצע R2 = 0.79 ± 0.08 היה מתקבל כאשר הנתונים הם 10 רשום על שני הצירים. הניסוי הראה כי שיטת שיפור ניתן להחיל על ערכה המסחרי אם משתמש את nanoprobes לצורך זיהוי או ניתן להתאים לצורך זיהוי מבוסס nanoprobe.
שיפור יעילות השיטה מסתמכת על שני היבטים קריטיים. זה חשוב להבטיח כי התערובת של פתרון 1, פתרון 2 הוא הומוגני. ללא תערובת הומוגנית, החיישן יהיה בקשר עם שברים של הפתרון שיפור איפה השולט לעומת השני פתרון 1 או 2. זה יקטין את היעילות של צמצום Au3 + Au0, ובכך לפגוע את היעילות של השיפור. חשוב גם שיהיה את כל שטח לטובת microarray בקשר עם הפתרון שיפור במהלך תקופת הדגירה.
כדי להשיג שיפור העדינה של אות, יידרש זמן דגירה ארוך (כ- 5 דקות) עם הפתרון שיפור. כדי למנוע ההתפתחות של רעש רקע זה יכול להתערב עם רכישת אות, השטח microarray צריך להיות שנחסם קודם לכן (למשל BSA, פג) כדי למנוע מהירה התצהיר לא ספציפי של יצירת0 והסוגר Au זהב שכבה.
מגבלה שיטת שיפור הוא מהותי היעילות של וזמינותו. וזמינותו מחייבת יש פקדים ואתאיזם המבטיחים שיפור האות נצפתה ניתן לייחס תוצאות אמת-חיוביות. אם יש שאינם ספציפיים ולאמוד nanoprobes עם המטרה, אותות רכשה לאחר שיפור לא יהיה חוקי.
טכניקות שיפור אחרות הן בהתאם גם צבירת ננו-חלקיק או ההגדלה של חלקיקים עם חומר המאפשר רכישת אות משופרת. באמצעות קידום הצטרפותם של מספר חלקיקים באתר זיהוי, רכישת אות ניתן יהיה גם מבחינה ויזואלית או מדידות UV-Vis. 5 טכניקות שיפור האות אלה מסתמכים על מערכת זיהוי שני שלבים, הגילוי הראשוני של analyte של עניין שלב שני שבו העיתונאית נדרשת כדי לאגד הבונה הזיהוי הראשוני. אסטרטגיות כאלה חסרי אוניברסאליות עקב הדרישה של שיפור מסוים פרוטוקול אופטימיזציה עבור כל סוג של וזמינותו.
טכניקות שיפור מוכתמים, כגון כסף מכתים, הרבה כמו פרוטוקול שהוצג כאן, לאפשר שיפור ישיר של המבנה זיהוי האות. עם זאת, בניגוד בפרוטוקול שמוצג כאן, צביעת כסף רק הוכח שיוחל או AuNPs או AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
תחולתה של שיטה זו סביר יכול להקיף כל assay המשתמשת AuNPs, AgNPs, IONPs או SiNPs כסוכני זיהוי. עבודה נוספת מתבצעת ללמוד את היישום של השיטה סנסורים המורכב של חומרים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
מימון של המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP/2007-2013) / ERC גרנט הסכם מס 615458, מועצת המחקר השבדי ומצוינות Pronova מרכז לטכנולוגיה חלבון (VINNOVA – שוודית סוכנות ממשלתית למערכות חדשנות) הוא הודה בהכרת תודה.
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |