Neste trabalho, é apresentado um protocolo para reforço de sinal da biosensing baseado em nano-sonda. O protocolo é baseado na redução do ácido cloroáurico na superfície do nanosondas existentes que consistem em ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro.
O uso de nanosondas tais como ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro como reagentes de detecção em ensaios bioanalíticos pode permitir alta sensibilidade e conveniente leitura colorimétrica. No entanto, altas densidades de nanopartículas são normalmente necessários para a deteção. Os protocolos disponíveis baseado em síntese realce são nanopartículas ou limitadas a ouro e prata ou dependem de otimização e controle preciso enzimático. Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar a leitura colorimétrica de ouro, prata, sílica e óxido de ferro nanosondas. Observou-se que o sinal colorimétrico pode ser melhorado por até um 10000-fold fator. A base para tais estratégias de reforço de sinal é a redução química de Au3 + Au0. Existem várias reações químicas que permitem a redução de Au3 + Au0. No protocolo, do bom buffers e H2O2 são utilizados e é possível favorecer a deposição de Au0 para a superfície da nanosondas existentes, em detrimento da formação de nanopartículas de ouro novas. O protocolo consiste a incubação do microarray com uma solução composta por Ácido cloroáurico e H2O2 no 2-(N-Morpholinos) tampão de pH ácido 6 etanesulfónico após o ensaio de detecção baseada em nano-sonda. A solução de reforço pode ser aplicada a sensores baseados em vidro e papel. Além disso, ele pode ser usado em imunoensaios comercialmente disponíveis como demonstrado pela aplicação do método para um microarray do alérgeno comercial. O desenvolvimento do sinal requer menos de 5 min de incubação com a solução de realce e a leitura pode ser avaliada ao olho nu ou dispositivos de aquisição de imagem low-end como um scanner de mesa ou uma câmera digital.
A utilização de nanomateriais como nanopartículas de ouro (AuNPs) ou nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) permitiu as aplicações em biosensing com versatilidade e sensibilidade melhorada. 1 a pletora de métodos desenvolvidos para a decoração da superfície de nanopartículas com vários ligantes, como tirar proveito de sua superfície elevada à relação do volume, permitiram a concepção de sensores com sensibilidade melhorada. 2 não obstante, uma ferramenta de biosensing é dependente do número de nanosondas necessários para conseguir um sinal detectável. Por exemplo, no caso de 40 nm AuNPs, para adquirir um sinal através de espectroscopia UV-vis, aproximadamente 90 × 106 nanosondas é necessária para detectar eficazmente o alvo de interesse. 3 essa limitação de densidade de nano-sonda pode ser contornada com o uso de amplificação de sinal. Tais estratégias4 pode basear-se na agregação interpartícula ou aglomeração, onde a densidade de nanosondas iniciais é aumentada por acumular um segundo conjunto de nanosondas após o primeiro. 5 aumento do número de nanopartículas em um determinado local na superfície sensor permite visual ou aquisição de sinal de UV-vis. No entanto, a sensibilidade do ensaio será inerentemente ligada à capacidade de direcionamento do segundo conjunto de nanopartículas para o conjunto inicial de nanosondas. Outras estratégias dependem da coloração de ouro e de prata nanosondas. 6 , 7 a coloração é conseguida através da redução de íons de prata para a superfície de nanopartículas, permitindo um visual ou detecção de UV-vis. 8 esses métodos aumentar o sinal de existir ouro ou prata nanosondas por potenciando a plasmon de superfície ressonância do sinal, não dependendo de eventos alvos secundários como métodos de aglomeração interpartícula. No entanto, métodos de coloração prateado só foram relatados com o uso de ouro ou prata nanosondas. 8 , 9
Em 2005, Zayats et al. 10 relataram a redução de íons Au para a superfície de ouro nanosondas para aumentar o sinal de ressonância de plasmon de superfície. Neste trabalho dependente da enzima, peróxido de hidrogênio foi gerado por catálise de glicose oxidase e juntamente com cloreto de cetyltrimethylammonium, permitida a redução do ácido cloroáurico.
Mais recentemente Wang et al. relatou um método de aprimoramento, onde uma camada de ouro é produzida na superfície da nanosondas existentes. 11 estes nanosondas alargadas exibido peroxidase-como a atividade catalítica contra o substrato 3 ‘, 5, 5 ‘-tetrametilbenzidina (TMB) que permite a visualização de uma cor azul brilhante olho nu.
Stevens et al . relatado o desenvolvimento de um ensaio de ELISA-baseado plasmônico. 12 após a detecção de um antigénio específico da próstata (PSA) através de uma estratégia de ELISA a tradicional, um anticorpo secundário marcado com catalase foi incubado com o sensor, após o qual o sensor estava imerso em uma solução contendo peróxido de hidrogênio e Ácido cloroáurico. A presença de catalase-modificado anticorpo secundário (resultado positivo) irá promover o consumo de água oxigenada, retardando a redução de Ácido cloroáurico e rendendo quase esférica monodispersas AuNPs com uma cor vermelha. A ausência do anticorpo da catalase-modificado (resultado negativo) permitiu a concentração de peróxido de hidrogênio permaneceu intacto, promovendo assim a redução rápida cloroáurico e rendendo AuNPs com morfologias mal-definidas responsáveis por uma cor azul/roxo . A concentração de peróxido de hidrogênio, determinado pela atividade da catalase, foi mostrada para ser correlacionada com a concentração do analito de interesse. A necessidade de um anticorpo secundário da catalase-modificado e o controle das condições da atividade catalítica são dois fatores que dificultam a universalidade desse método. Além disso, a formação de clusters de ouro, independentes do AuNPs existentes, pode apresentar problemas de ruído de fundo a estratégia de amplificação.
As técnicas acima mencionadas, como também vários outros13,14,15, tornaram possível para biossensores baseados em nano-sonda atingir limites de detecção, a par com as técnicas tradicionais.
Aqui, um método de aprimoramento de ouro romance é demonstrado, onde o sinal de um nano-sonda existente é amplificado por potenciando ou introduzir um sinal de ressonância de plasmon de superfície. Após a deteção é realizada com o uso de ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro, o sensor é permitido para incubar com uma solução de uma mistura de peróxido de hidrogênio e o Ácido cloroáurico em 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico ácido tampão de pH 6 (MES). As concentrações dos componentes da solução de realce foram otimizadas para favorecer a deposição de Au0 na superfície da nanosondas existentes. Para todos estudaram tipos de nanossondas, i. e. AuNPs, nanopartículas de prata (AgNPs), nanopartículas de sílica (SiNPs) e IONPs, a formação de uma camada mal-definidas renderam ou aumentada a dispersão da luz, o que resultou em um sinal visível aumento ou detectável. Um aumento de sinal com um fator de amplificação de 100 vezes foi conseguido para nanosondas em microarrays baseada em vidro e papel e o processo leva menos de 5 min para adquirir um sinal. A aquisição de sinal poderia ser feita a olho nu, espectroscopia UV-vis ou imagem ferramentas low-end, tais como uma câmera digital ou um scanner de mesa. Além disso, foi demonstrado que este protocolo de aprimoramento pode ser aplicado facilmente em um ensaio de diagnóstico de alergia comercialmente disponível sem a necessidade de otimização específica.
Atualmente, técnicas de realce de sinal para ensaios com detecção baseada em nano-sonda são ambos enzimáticos12, exigem um segundo conjunto de nanopartículas para a deteção nanosondas21 de destino ou, no caso de técnicas de coloração, são limitadas a o uso de AuNPs ou AgNPs, como detecção de sondas. 22 aqui, um método simples, rápido e livre de enzima é descrito para o realce do sinal dos ensaios de detecção-baseado de nanossondas. Com este método, foi possível melhorar o sinal colorimétrico fornecido por 4 tipos de nanosondas: AuNPs, AgNPs, IONPs e SiNPs.
O fator de amplificação observada para cada conjunto de nanosondas foi de 100-fold, exceto para o SiNPs onde a quantificação do fator de aprimoramento não foi possível devido à falta de sinais de pré-melhoramento. Este factor de intensificação sugere que a eficiência do protocolo é semelhante em todos os tipos de nanossondas. Além disso, quando o protocolo de realce foi executado em um suporte de papel, onde uma série de diluições de uma suspensão de AuNPs das ações foi impresso, observou-se um fator de 10000-fold de amplificação. Anterior ao realce, as manchas visíveis com o menor número de AuNPs foram onde aproximadamente 10000 nanopartículas foram impressos, realce as manchas abrigando nanopartículas de menos de 10 tornou-se visível. 20
As condições estabelecidas para o protocolo de realce aqui apresentado permitiram aproveitando-se da redução da Au3 + Au0 para melhorar o sinal, mantendo-se o ruído de fundo a um mínimo. O reforço pode ser realizado logo após o ensaio é realizado, bem como em Microarrays do que foram armazenados por até vários meses após o ensaio foi realizado. A solução de reforço consiste em uma mistura 1:1 de solução 1 e 2 de solução. Ambas as soluções podem ser previamente misturadas ou misturadas diretamente quando pipetado para o microarray. A diferença entre pré-mistura ou direto mistura afeta apenas a validade da solução de realce. Quando pré-misturados a validade é de 5-7 dias, aumentando para 30-45 dias se não pre-misturada.
Uma análise mais aprofundada dos resultados mostrou que o método de aprimoramento não interfere na análise quantitativa do biosensor. Uma correlação linear entre a intensidade observada e a concentração do analito foi mantida (tabela 1). Os dados obtidos para 4 amostras clínicas pré-caracterizadas usando o imunoensaio de microarray de componente alérgeno com base em vidro, com detecção de fluorescência padrão e Detecção colorimétrica, mostram uma boa concordância entre os dois métodos de detecção. Comparando a intensidade de fluorescência média (IFM) e a média intensidade colorimétrica (MCI), uma média R2 = 0,79 + /-0,08 obteve-se quando os dados são 10-conectado em ambos os eixos. Esta experiência mostrou que o método de reforço pode ser aplicado a um kit comercial se usa as nanosondas para deteção ou pode ser adaptado para detecção baseada em nano-sonda.
A eficácia do método de aprimoramento depende de dois aspectos críticos. É importante garantir que a mistura da solução 1 e 2 de solução é homogênea. Sem uma mistura homogênea, o sensor será em contacto com frações da solução de melhoria onde solução 1 ou 2 é predominante em relação a outras. Isso reduzirá a eficiência da redução da Au3 + Au0, assim, prejudicar a eficiência do reforço. Também é importante ter toda a área de interesse do microarray em contacto com a solução de reforço durante o período de incubação.
Para conseguir ultra-sensível realce de um sinal, um longo tempo de incubação (aproximadamente 5 min) com a solução de melhoria serão necessário. Para evitar o desenvolvimento do ruído de fundo que possa interferir com a aquisição de sinal, a superfície de microarray deve ser previamente bloqueados (por exemplo, BSA, PEG) para evitar a rápida deposição inespecífica de Au0 e consequente formação de um ouro camada.
Uma limitação para o método de realce é a eficácia intrínseca do ensaio. O ensaio requer ter controles positivos e negativos a garantir que o reforço de sinal observado pode ser atribuído ao verdadeiro-positivos resultados. Se houver uma interação não-específica das nanosondas com o alvo, sinais adquiridos após realce não será válido.
Outras técnicas de realce são baseadas em qualquer agregação de nanopartículas ou coloração das nanopartículas com um material que permite a aquisição do sinal melhorado. Promovendo o encontro do número de nanopartículas no local da deteção, a aquisição de sinal será possível também visualmente ou medidas de UV-Vis. 5 estas técnicas de reforço de sinal dependem de um sistema de detecção de duas etapas, a detecção inicial do analito de interesse e uma segunda etapa, onde o repórter é necessário para vincular a detecção inicial de construção. Tais estratégias faltam universalidade devido à exigência de otimização de protocolo acessório específico para cada tipo de ensaio.
As técnicas de realce de coloração, tais como prata, coloração, bem como o protocolo aqui apresentado, permitam o reforço direto das construções de deteção de sinal. No entanto, ao contrário do protocolo que é mostrado aqui, coloração prata só foi mostrado para ser aplicado a AuNPs ou AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
A aplicabilidade desse método provavelmente poderia abranger qualquer ensaio que usa AuNPs, AgNPs, IONPs ou SiNPs, como agentes de deteção. Prosseguir o trabalho está sendo realizado para estudar a aplicação do método em sensores de outras matérias.
The authors have nothing to disclose.
Financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP/2007-2013) / ERC Grant acordo n. º 615458, o Conselho Sueco de pesquisa e excelência Pronova centro de tecnologia de proteína (VINNOVA – Sueco Agência governamental para sistemas de inovação) é reconhecida com gratidão.
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |