In questo lavoro, un protocollo per il potenziamento del segnale di biosensori basati su Nanosonda è presentato. Il protocollo si basa sulla riduzione di acido cloroaurico sulla superficie di nanosonde esistenti costituiti da oro, argento, quarzo o nanoparticelle di ossido di ferro.
L’uso di nanosonde come oro, argento, silice o nanoparticelle di ossido di ferro come reagenti di rilevamento nei saggi bioanalitici può consentire ad alta sensibilità e comoda lettura colorimetrica. Tuttavia, alte densità di nanoparticelle sono in genere necessari per il rilevamento. I protocolli di potenziamento basato su sintesi disponibili sono entrambi limitati a oro e argento nanoparticelle o si basano su ottimizzazione e preciso controllo enzimatico. Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la lettura colorimetrica di oro, argento, silice e ossido di ferro nanosonde. È stato osservato che il segnale colorimetrico può essere migliorato fino ad un 10000-fold fattore. La base per tali strategie di potenziamento del segnale è la riduzione chimica del Au3 + Au0. Ci sono parecchie reazioni chimiche che permettono la riduzione del Au3 + Au0. Nel protocollo, di buon buffer e H2O2 sono utilizzati ed è possibile favorire la deposizione di Au0 sulla superficie di nanosonde esistenti, a scapito della formazione di nuove nanoparticelle d’oro. Il protocollo comprende l’incubazione del microarray con una composto di acido cloroaurico e H2O2 in 2-(N-morfolino) di soluzione tampone a pH acido 6 etansolfonico seguendo il dosaggio di rilevamento basati su Nanosonda. La soluzione di valorizzazione può essere applicata alla carta e sensori basati su vetro. Inoltre, può essere utilizzato nei immunoassays commercialmente disponibili come dimostrato dall’applicazione del metodo ad un microarray di allergene commerciale. Lo sviluppo di segnale richiede meno di 5 minuti di incubazione con la soluzione di valorizzazione e la lettura può essere valutata dall’occhio nudo o periferiche di acquisizione immagini low-end come un tavolo scanner o una fotocamera digitale.
L’utilizzo di nanomateriali quali nanoparticelle d’oro (AuNPs) o nanoparticelle di ossido di ferro (IONPs) ha permesso le applicazioni in biosensori con versatilità e sensibilità migliorata. 1 la pletora dei metodi sviluppati per la decorazione della superficie delle nanoparticelle con vari ligandi, quanto a sfruttare la loro alta superficie in rapporto al volume, hanno permesso la progettazione di sensori con sensibilità migliore. 2 nondimeno, uno strumento di biosensori è dipenda dal numero di nanosonde necessaria per ottenere un segnale rilevabile. Ad esempio, nel caso di 40 nm AuNPs, di acquisire un segnale attraverso spettroscopia UV-vis, circa 90 × 106 nanosonde è necessaria al fine di rilevare in modo efficace il target di interesse. 3 questa limitazione di densità Nanosonda può essere aggirata attraverso l’uso di amplificazione del segnale. Tali strategie4 può essere basato su aggregazione interparticella o agglomerato, dove la densità di nanosonde iniziale è aumentata accumulando un secondo set di nanosonde sul primo. 5 aumentando il numero delle nanoparticelle in una determinata posizione su una superficie di sensore consente visual o acquisizione del segnale UV-vis. Tuttavia, la sensibilità del test sarà intrinsecamente collegata alla capacità di targeting del secondo set di nanoparticelle verso il set iniziale di nanosonde. Altre strategie si basano sulla macchiatura di nanosonde sia oro e argento. 6 , 7 la colorazione è ottenuta attraverso la riduzione degli ioni d’argento sulla superficie delle nanoparticelle, consentendo un visual o rilevazione UV-vis. 8 questi metodi che permettono di migliorare il segnale di esistenti d’oro o d’argento nanosonde rafforzando il plasmone di superficie risonanza del segnale, non a seconda di eventi secondari targeting come nei metodi di agglomerazione interparticella. Tuttavia, i metodi di colorazione argento sono stati segnalati solo con uso di nanosonde di oro o argento. 8 , 9
Nel 2005, Zayats et al. 10 segnalato la riduzione degli ioni Au sulla superficie dell’oro nanosonde per aumentare il segnale di risonanza plasmonica di superficie. In questo lavoro di enzima-dipendente, perossido di idrogeno è stato generato da catalisi di glucosio ossidasi e insieme cetiltrimetilammonio cloruro ha permesso la riduzione di acido cloroaurico.
Più recentemente Wang et al. ha riferito un metodo di valorizzazione dove si produce uno strato d’oro sulla superficie delle nanosonde esistente. 11 queste nanosonde allargate visualizzato perossidasi-come attività catalitica contro il substrato 3 ′, 5, 5 ‘-tetrametilbenzidina (TMB) che consente la visualizzazione di un colore blu brillante ad occhio nudo.
Stevens et al. ha segnalato lo sviluppo di un test ELISA plasmonico. 12 dopo il rilevamento di un antigene prostatico specifico (PSA) attraverso una tradizionale strategia di ELISA, un anticorpo secondario marcato con catalasi è stato incubato con il sensore dopo che il sensore è stato immerso in una soluzione contenente perossido di idrogeno e acido cloroaurico. La presenza di anticorpo secondario di catalasi-modificato (risultato positivo) sarebbe promuovere il consumo di acqua ossigenata, rallentando la riduzione di acido cloroaurico e producendo quasi sferico monodispersed AuNPs con un colore rosso. L’assenza dell’anticorpo catalasi-modificato (risultato negativo) ha permesso la concentrazione di perossido di idrogeno a rimanere intatto, favorendo così la riduzione rapida cloroaurico e producendo AuNPs con mal definite morfologie responsabile di un colore blu/viola . La concentrazione di perossido di idrogeno, determinato dall’attività della catalasi, è stata indicata per essere correlato alla concentrazione dell’analita di interesse. La necessità di un anticorpo secondario catalasi-modificato e il controllo delle condizioni dell’attività catalitica sono due fattori che ostacolano l’universalità di questo metodo. Inoltre, la formazione di raggruppamenti oro, indipendente di AuNPs esistente, può introdurre problemi di rumore di sfondo per la strategia di amplificazione.
Le tecniche sopra menzionate, come anche molti altri13,14,15, hanno reso possibile per biosensori basati su Nanosonda raggiungere limiti di rilevazione alla pari con tecniche tradizionali.
Qui, è dimostrato un metodo novello aumento dell’oro, dove il segnale di un Nanosonda esistente è amplificato dalla potenzianti o l’introduzione di un segnale di risonanza plasmonica di superficie. Dopo la rilevazione è effettuata con l’uso di oro, argento, quarzo o nanoparticelle di ossido di ferro, il sensore è lasciato incubare con una soluzione di una miscela di perossido di idrogeno e acido cloroaurico in 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido tampone a pH 6 (MES). Le concentrazioni dei componenti della soluzione di valorizzazione sono state ottimizzate per favorire la deposizione di Au0 sulla superficie delle nanosonde esistente. Tutti studiato Nanosonda tipi, vale a dire. AuNPs, nanoparticelle d’argento (AgNPs), nanoparticelle di silice (SiNPs) e IONPs, la formazione di uno strato mal definito ceduto o aumentata la dispersione della luce che ha provocato un segnale rilevabile o aumento visibile. Un aumento di segnale con un fattore di amplificazione 100 volte è stato raggiunto per nanosonde in carta e base di vetro microarrays e il processo richiede meno di 5 minuti per acquisire un segnale. L’acquisizione del segnale potrebbe essere fatto da occhio nudo, spettroscopia UV-vis o strumenti di fascia bassa come una fotocamera digitale o uno scanner da tavolo di imaging. Inoltre, è stato dimostrato che questo protocollo valorizzazione può essere applicato facilmente in un test diagnostico di allergia commercialmente disponibili senza la necessità di ottimizzazione specifica.
Attualmente, tecniche di aumento del segnale per le analisi con rilevazione basata su Nanosonda sono entrambi basati su enzima12, richiedono un secondo set di nanoparticelle per destinazione il rilevamento nanosonde21 o, nel caso di tecniche di colorazione, sono limitate a l’uso di AuNPs o AgNPs come sonde di rilevamento. 22 qui, un metodo semplice, veloce e privo di enzima è descritto per il potenziamento del segnale di saggi basati sul rilevamento Nanosonda. Con questo metodo, è stato possibile migliorare il segnale colorimetrico fornito da 4 tipi di nanosonde: AuNPs, AgNPs, IONPs e SiNPs.
Il fattore di amplificazione osservata per ogni set di nanosonde era di 100 volte, tranne per il SiNPs dove non era possibile a causa della mancanza di segnali di pre-miglioramento quantificazione del fattore di potenziamento. Questo fattore di potenziamento suggerisce che l’efficienza del protocollo è simile in tutti i tipi di nanosonde. Inoltre, quando il protocollo di potenziamento è stato effettuato su un supporto di carta dove è stata stampata una serie di diluizioni di una sospensione AuNPs stock, è stato osservato un fattore di 10000-fold amplificazione. Precedente alla valorizzazione, le macchie visibili con il minor numero di AuNPs erano dove sono state stampate circa 10000 nanoparticelle, dopo il miglioramento le macchie che harboring le nanoparticelle meno di 10 è diventato visibile. 20
Le condizioni stabilite per il protocollo di potenziamento qui presentato hanno permesso approfittando della riduzione di Au3 + Au0 per migliorare il segnale, mantenendo al minimo il rumore di fondo. La valorizzazione può essere eseguita subito dopo il test viene fatto così come sui microarrays che sono stati conservati per fino a parecchi mesi dopo l’analisi è stata eseguita. La soluzione di valorizzazione è costituito da una miscela di 1:1 di soluzione 1 e soluzione 2. Entrambe le soluzioni possono essere precedentemente mescolate o misti direttamente quando pipettato sul microarray. La differenza tra pre-miscelazione o miscelazione diretta colpisce solo la shelf-life della soluzione di potenziamento. Quando pre-miscelati la shelf-life è di 5-7 giorni aumenta a 30-45 giorni se non pre-miscelata.
Un’ulteriore analisi dei risultati ha mostrato che il metodo di valorizzazione non interferisce con l’analisi quantitativa del biosensore. Una correlazione lineare tra l’intensità osservata e la concentrazione dell’analita è stata mantenuta (tabella 1). I dati ottenuti per 4 campioni clinici pre-caratterizzati usando il base di vetro allergene componente microarray immunoassay, con rilevazione della fluorescenza standard e rilevazione colorimetrica, ha mostrato una buona concordanza tra i due metodi di rilevamento. Confronto tra l’intensità media di fluorescenza (MFI) e l’intensità media colorimetrico (MCI), un media R2 = 0.79 + /-0.08 è stata ottenuta quando i dati sono registrati 10 su entrambi gli assi. Questo esperimento ha mostrato che il metodo di valorizzazione può essere applicato a un kit commerciale se utilizza le nanosonde per il rilevamento o può essere adattato per rilevazione basata su Nanosonda.
L’efficacia del metodo di valorizzazione si basa su due aspetti critici. È importante assicurare che la miscela di soluzione 1 e soluzione 2 è omogeneo. Senza una miscela omogenea, il sensore sarà a contatto con le frazioni della soluzione di valorizzazione dove è predominante rispetto a altra soluzione 1 o 2. Che ridurrà l’efficienza della riduzione di Au3 + Au0, danneggiando così l’efficienza del potenziamento. È anche importante avere l’intera area di interesse del microarray a contatto con la soluzione di aumento durante il periodo di incubazione.
Per raggiungere ultrasensibile valorizzazione di un segnale, un tempo di incubazione più lungo (circa 5 min) con la soluzione di aumento sarà richiesto. Per evitare lo sviluppo di rumore di fondo che possa interferire con l’acquisizione del segnale, la superficie di microarray deve essere precedentemente bloccati (ad es. BSA, PEG) per evitare la rapida deposizione aspecifici di Au0 e conseguente formazione di un oro strato.
Una limitazione per il metodo di valorizzazione è l’efficacia intrinseca del dosaggio. Il test richiede avere controlli negativi e positivi da garantire che il potenziamento del segnale osservato può essere attribuito a risultati positivi true. Se c’è un’interazione aspecifica delle nanosonde con il bersaglio, segnali acquisiti dopo aumento non sarà valido.
Altre tecniche di valorizzazione si basano sulla o aggregazione di nanoparticelle o colorazione delle nanoparticelle con un materiale che consente l’acquisizione del segnale migliorata. Promuovendo la raccolta del numero di nanoparticelle presso il sito di rilevamento, l’acquisizione del segnale sarà possibile sia visivamente o misurazioni UV-Vis. 5 queste tecniche di potenziamento del segnale si basano su un sistema di rilevazione in due fasi, la rilevazione iniziale dell’analita di interesse e una seconda fase dove il reporter è necessario per associare al costrutto di rilevamento iniziale. Tali strategie non universalità a causa della necessità di ottimizzazione dei protocolli specifici di potenziamento per ogni tipo di analisi.
Le tecniche di potenziamento colorazione, come macchiatura d’argento, molto come il protocollo qui presentato, consentono la valorizzazione diretta dei costrutti di rilevamento segnale. Tuttavia, a differenza del protocollo che è mostrato qui, macchiatura d’argento ha solo dimostrata di essere applicato a AuNPs o AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
L’applicabilità di questo metodo probabilmente potrebbe estendersi su qualsiasi test che utilizza AuNPs, AgNPs, IONPs o SiNPs come agenti di rilevamento. Ulteriore lavoro è svolto per studiare l’applicazione del metodo in sensori costituiti da altri materiali.
The authors have nothing to disclose.
Finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell’ambito settimo programma dell’Unione europea quadro (FP/2007-2013) / ERC Grant accordo n. 615458, il Consiglio svedese della ricerca ed eccellenza Pronova centro per tecnologia della proteina (VINNOVA – svedese Si ringraziano l’agenzia governativa per i sistemi innovativi).
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |