Chemoreceptor Ligand बाइंडिंग डोमेन के कुशल रिसामने और शुद्धिकरण के लिए विधि
Summary
एक प्रक्रिया को शामिल निकायों से dCACHE periplasmic ligand बंधन डोमेन के कैम्पिलोबैक्टर jejuni chemoreceptor Tlp3 का खुलासा करने के लिए प्रस्तुत किया है और शुद्धि के लिए प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा उपज ।
Abstract
ligand विशिष्टता के आणविक आधार के elucidation के उद्देश्य से chemoreceptors और संरचनात्मक अध्ययन के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, शुद्ध, जोड़ मिलीग्राम बाइंडिंग डोमेन के ligand मात्रा के उत्पादन के द्वारा काफी सुविधा हो सकती है । ई कोलाई (ई. कोलाई) में बैक्टीरियल chemoreceptors की एक्सप्रेस periplasmic ligand बंधन डोमेन heterologously करने के लिए प्रयास अक्सर शामिल निकायों में अपने लक्ष्यीकरण में परिणाम । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया जाता है, इसका खुलासा और शुद्धि, periplasmic dCACHE ligand बाइंडिंग डोमेन का उपयोग कर कैम्पिलोबैक्टर jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 एक उदाहरण के रूप में । दृष्टिकोण एक सट अपने6टैग, अलगाव और यूरिया के साथ ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल निकायों के मध्यस्थता solubilisation, यूरिया कमी के द्वारा पुनः प्रकट प्रोटीन, और समानता के माध्यम से शुद्धि क्रोमैटोग्राफी, टैग हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया । परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह प्रदर्शित किया गया है कि इस प्रोटोकॉल आम तौर पर एक घुलनशील और chemoreceptors रूप में अंय जीवाणु crystallisable के dCACHE periplasmic ligand बाध्यकारी डोमेन के मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए उपयोगी है ।
Introduction
Chemotaxis और गतिशीलता को होस्ट1,2,3के बैक्टीरियल रोगजनन और आक्रमण को बढ़ावा देकर कैम्पिलोबैक्टर jejuni colonisation में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते दिखाया गया है । Chemotaxis बैक्टीरिया विकास के लिए एक इष्टतम वातावरण की ओर जाने के लिए अनुमति देता है, के रूप में रासायनिक संकेतों द्वारा निर्देशित । इस प्रक्रिया में प्रोटीन का एक सेट chemoreceptors, या transducer की तरह प्रोटीन (Tlps) के द्वारा intracellular और पर्यावरणीय रासायनिक संकेतों की मांयता शामिल है । अधिकांश chemoreceptors एक extracytoplasmic ligand बाइंडिंग डोमेन (LBD), एक transmembrane डोमेन और एक cytoplasmic संकेत डोमेन के साथ झिल्ली-एंबेडेड प्रोटीन होते हैं, जिसके बाद संकेत संचारित करने वाले cytosolic संकेत प्रोटीन के साथ इंटरैक्ट करता है को flagellar मोटर्स4,5,6,7।
ग्यारह विभिन्न chemoreceptors की पहचान सी. jejuni जीनोम4,8में की गई है । तारीख करने के लिए, इन chemoreceptors के केवल कुछ विशेषता है और Tlp1 के ligand विशिष्टता9, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, और Tlp1113 है जाना जाता है । इस प्रजाति में शेष chemoreceptors के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, और अन्य जीवाणुओं में कई chemoreceptors, तह और अत्यधिक शुद्ध रिकॉमबिनेंट chemoreceptor LBDs14के उत्पादन द्वारा बहुत सुविधा हो सकती है, 15 , 16. हालांकि, heterologously एक्सप्रेस periplasmic LBDs में बैक्टीरियल chemoreceptors के प्रयास ई कोलाई में अक्सर परिणाम को शामिल करने के निकायों में उनके लक्ष्यीकरण में17,18,19 . फिर भी, इस घटना आसान अलगाव और हाथ में प्रोटीन की वसूली की सुविधा कर सकते हैं । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया है, इसका खुलासा और शुद्धि, एक उदाहरण के रूप में ग. jejuni chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD का उपयोग कर । इस उदाहरण चुना गया था क्योंकि Tlp3-LBD संवेदन डोमेन के dCACHE परिवार20 के अंतर्गत आता है जो बहुतायत से दो घटक histidine kinases और chemoreceptors में prokaryotes20,21में पाया जाता है, 22 , 23.
इस दृष्टिकोण में, अभिव्यक्ति का निर्माण, एक pET151/D-टोपो वेक्टर के आधार पर, एक N-टर्मिनल को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है6-एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) के बाद टैग को छेड़ो दरार साइट, बाद में टैग हटाने के लिए19। प्रोटोकॉल ई. कोलाई, अलगाव और यूरिया-शामिल किए जाने वाले निकायों के मध्यस्थता solubilisation में प्रोटीन की कमी का वर्णन है, और प्रोटीन यूरिया घट द्वारा पुनः प्रकट । बाद में, नमूना अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है, वैकल्पिक टैग को हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ । शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर पुष्टि की है । इस विधि का एक संशोधित संस्करण है कि पहले से ठीक है और एक अलग chemoreceptor, Helicobacter हेलिकोबेक्टर TlpC19के LBD शुद्ध विकसित किया गया है । यह प्रक्रिया, चित्रा 1में संक्षिप्त, पैदावार 10-20 शुद्ध, untagged Tlp3-LBD प्रति 1 बैक्टीरियल संस्कृति के एल, के एक प्रोटीन शुद्धता के साथ > 90% के रूप में एसडीएस द्वारा अनुमानित-पृष्ठ ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अभिव्यक्ति के लिए एक सरल प्रक्रिया और बैक्टीरियल chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD के शामिल निकायों से गुना प्रस्तुत किया है । शुद्ध प्रोटीन की तैयारी से अधिक की अभिव्यक्ति शामिल है पीईटी-प्लाज्मिड-एनकोडेड जीन में ई….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Tlp3-LBD उत्पादन पर अपने शुरुआती काम के लिए यू सी लियू धंयवाद । मायरा ए. Machuca डॉक्टरी छात्रवृत्ति के लिए Departamento Admistrativo डे Ciencia, Tecnología ई Innovación COLCIENCIAS का ऋणी है ।
Materials
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
Referências
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