Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Chemotaxis en motiliteit is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de pathogenese van Campylobacter jejuni door bacteriële kolonisatie en invasie van de host^1,2,3te bevorderen. Chemotaxis kan bacteriën toewerken naar een optimale omgeving voor de groei, als geleid door chemische signalen. Dit proces omvat erkenning van intracellulaire en milieu chemische signalen door een aantal eiwitten genoemd chemoreceptors of transducer-achtige eiwitten (Tlps). De meeste chemoreceptors zijn membraan-embedded eiwitten met een extracytoplasmic ligand bindend domein (LBD), een transmembraan domein en een cytoplasmatische seingeving domein, de laatste van die samenwerkt met de cytosolische signalering eiwitten die het signaal zenden motoren aan de flagellar^4,5,6,7.

Elf verschillende chemoreceptors er zijn geïdentificeerd in de C. jejuni genoom^4,8. Tot op heden, slechts enkele van deze chemoreceptors hebben gekenmerkt en de specificiteit van de ligand van Tlp1⁹, Tlp3^10,11, Tlp4¹¹, Tlp7¹², en Tlp11-¹³ is bekend. Identificatie van de natuurlijke liganden van de resterende chemoreceptors in deze soort, en talrijke chemoreceptors in andere bacteriën, kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van gevouwen en zeer zuiver recombinante chemoreceptor LBDs^{14, 15 , 16}. uitspreken geïnfecteerd periplasmische LBDs van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli vaak resulteren in hun doelgerichtheid in de integratie-organen^17,18,19 . Niettemin, dit fenomeen kan vergemakkelijken eenvoudig isolatie en herstel van het eiwit in de hand. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van integratie-organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische LBD van de C. jejuni chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. In het volgende voorbeeld werd gekozen omdat Tlp3-LBD behoort tot de dCACHE familie²⁰ van teledetectie domeinen die overvloedig in tweecomponenten histidine kinases en chemoreceptors in prokaryoten^20,21, gevonden zijn ^{22 , 23}.

In deze benadering de constructie voor de expressie, op basis van een pET151/D-TOPO vector, is ontworpen om het nemen van een N-terminal zijn-₆-label, gevolgd door een tabak etch virus (TEV) protease breukzijde, voor latere tag verwijdering¹⁹. Het protocol beschrijft eiwit overexpressie in E. coli, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen en eiwit uiteinde van ureum uitputting. Volgende uiteinde, het monster wordt gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit, met optionele tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De gevouwen staat van het gezuiverde eiwit wordt bevestigd met behulp van circulair dichroïsme spectroscopie. Dit is een gewijzigde versie van de methode die eerder is ontwikkeld om te herstellen en zuiveren van de LBD van een verschillende chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC¹⁹. Deze procedure, samengevat in Figuur 1, levert 10-20 mg zuivere, niet-gecodeerde Tlp3-LBD per 1 liter van bacteriële cultuur, met een zuiverheid van de proteïnen van > 90% zoals geraamd door SDS-PAGE.