Процедура представлен складывая dCACHE периплазматическое лигандом привязки области Campylobacter jejuni Хеморецепция Tlp3 от включения органов и очистки приносить миллиграмм количества белка.
Идентификация природных лигандов хеморецепторы и структурных исследований, направленных на выяснение молекулярные основы лигандом специфики может быть значительно облегчено производства количествах миллиграмм чистой, сложить лигандом связывания доменов. Попытки участием Экспресс периплазматическое лигандом связывания доменов бактериальной хеморецепторов в Escherichia coli (E. coli) часто привести их ориентации в включение тела. Здесь для восстановления белка от включения органов, складывая и очистки, используя домен привязки лигандом периплазматическое dCACHE Campylobacter jejuni (C. jejuni) Хеморецепция Tlp3 качестве примера представлен метод. Этот подход включает в себя выражение протеина интереса с горные его6-тег, изоляции и мочевина опосредованной solubilisation включения органов, белка, складывая мочевины истощения, и очистки с помощью аффинной хроматографии, Затем тег удаления и размер исключения хроматографии. Спектроскопия круговой дихроизма используется для подтверждения сложенном состоянии чистого белка. Было продемонстрировано, что этот протокол является обычно полезно для производства количествах миллиграмм dCACHE периплазматическое лигандом связывания доменов других бактериальная хеморецепторов в виде растворимых и кристаллизирующихся.
Было показано, что хемотаксис и моторики играют важную роль в патогенезе Campylobacter jejuni , содействуя бактериальной колонизации и вторжения в узел1,2,3. Хемотаксис позволяет бактерии продвигаться к оптимальной среды для роста, как руководствоваться химические сигналы. Этот процесс предполагает признание внутриклеточные и экологических химические сигналы набор белков, называемых хеморецепторы, или датчика подобных белков (ПСТЛ). Большинство хеморецепторов являются белками мембраны встроенный с extracytoplasmic лигандом привязки домена (ОДД), трансмембранных доменов и цитоплазматических сигнализации домена, последний из которых взаимодействует с цитозольной сигнальных белков, которые передают сигнал flagellar моторы4,5,6,7.
Одиннадцать различных хеморецепторов были определены в геном C. jejuni ,4,,8. На сегодняшний день, только некоторые из этих хеморецепторов характеризовали и специфика лигандом Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712и Tlp1113 известен. Идентификация природных лигандов оставшиеся хеморецепторов в этой породы, и многочисленные хеморецепторов в других бактерий, может быть существенно облегчено производство рекомбинантных Хеморецепция складывается и высоки чисто LBDs14, 15 , 16. Однако попытки участием Экспресс периплазматическое LBDs бактериальной хеморецепторов в Escherichia coli часто приводить их ориентации на включение органов17,18,19 . Тем не менее это явление может облегчить легко изоляции и восстановления белка в руке. Здесь для восстановления белка от включения органов, складывая и очистки, используя периплазматическое LBD C. jejuni Хеморецепция Tlp3 качестве примера представлен метод. Этот пример был выбран потому, что Tlp3-LBD принадлежит dCACHE семьи20 зондирования доменов, которые обильно нашли в двухкомпонентных гистидина киназы и хеморецепторов в прокариотах20,21, 22 , 23.
В этом подходе, конструкции выражения, основанные на pET151/D-TOPO вектор, был разработан для включения N-терминальный его6-тега, после чего табак etch вирус (TEV) протеазы расщепления сайта, для последующего тег удаления19. Протокол описывает гиперэкспрессия белка в E. coli, изоляции и мочевина опосредованной solubilisation включения органов, и белок, складывая мочевины истощения. После складывая, образец очищается хромотографией сродства с необязательный тег удаления и размер исключения хроматографии. Сложенном состоянии очищенный протеин подтверждается с помощью круговой дихроизма спектроскопии. Это измененная версия метода, который был ранее разработан чтобы восстановить и очистить LBD различных Хеморецепция, Helicobacter pylori TlpC19. Эта процедура, резюмируется в Рисунок 1, дает 10-20 мг чистого, без тегов Tlp3-LBD на 1 Л бактериальной культуры, с чистотой белка > 90% по оценкам SDS-PAGE.
Простая процедура для выражения и складывая от включения органов периплазматическое LBD бактериальных Хеморецепция Tlp3 представлен. Подготовка чистого белка подразумевает гиперэкспрессия кодировке ПЭТ плазмид ген в E. coli, очистки и solubilisation включения органов, складывая денатуриров…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Yu C. Лю за его ранние работы на Tlp3-LBD производство. Майра A. Мачука долгу Departamento Admistrativo де науки, Tecnología e Innovación материалом для докторской стипендии.
Tris base | AMRESCO | 497 | |
Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |