Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Clostridium difficile é uma das principais causas de infecções diarreia associada a antibióticos nosocomiais 1. Esta bactéria anaeróbia Gram-positiva são transmitidos através da sua forma de esporos através da via fecal-oral. Na década passada, o novo '' epidemia '' ou '' hipervirulento '' estirpes (por exemplo BI / NAP1 / 027) causou um aumento drástico em novas infecções e taxas de mortalidade na América do Norte e na Europa 2. C. doença -associated difficile (CDAD) é uma ameaça à vida inflamação do cólon com altas taxas de mortalidade 3. Os sintomas variam de 4 a diarreia colite pseudomembranosa 5 e o megacólon tóxico, muitas vezes fatal 6.
Tratamento de CDAD é difícil, pois as estirpes virulentas são multi-resistente ea taxa de recorrência é alta 7. No momento em terapia inclui a antibióticos metronidazol, vancomicina ou fidaxomicina, ou em repetiticasos recorrentes vely transplante de microbiota fecal. Novas estratégias terapêuticas são urgentemente necessários 8. Algum progresso está registada como a terapêutica anticorpo monoclonal Bezlotoxumab, visando C. difficile Toxina B 9, foi recentemente passou com êxito ensaios clínicos fase III e foi apresentado para aprovação com a FDA e EMA. Adicionalmente, novos antibióticos estão a ser testado no momento em diferentes fases de ensaios clínicos 10.
Para desenvolver um tratamento eficaz novos alvos terapêuticos devem ser identificados. O recém-descoberto C. difficile protease endopeptidase-1 prolina-prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) é um alvo tão promissor, como a falta de PPEP-1 em uma cepa knock-out diminui virulência de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 é uma metaloprotease segregada 12,13 clivagem dois adesinas de C. difficile no seu terminal C 13, libertando assim o bacter aderenteIA a partir do epitélio do intestino humano. Portanto, está envolvido na manutenção do equilíbrio entre o fenótipo séssil e móveis de C. difficile. Para desenvolver inibidores selectivos contra PPEP-1 e para entender como ele reconhece seus substratos conhecimento íntimo de sua estrutura tridimensional é indispensável. Nós resolvemos a primeira estrutura cristalina de PPEP-1 sozinho e em complexo com um péptido substrato 14. PPEP-1 é a protease primeiro conhecido que cliva selectivamente ligações peptídicas entre os dois resíduos de prolina 15. Liga-se o substrato de um modo duplamente dobrada e estabiliza através de uma rede alifático-aromático prolongado de resíduos localizados no S-ciclo que abrange o local de protease activa 14. Este modo de ligação de substrato é exclusivo para PPEP-1 e não foi encontrado na proteases humanos até à data. Isto o torna um alvo terapêutico promissor, e fora do alvo efeitos de inibidores muito improvável.
Para desenvolver e tela seletiva PPEP-1 habibitors no futuro, é necessária uma grande quantidade de proteína pura e monodispersas PPEP-1. Além disso, para determinar o modo de ligação dos primeiros inibidores, as estruturas de co-cristal com PPEP-1 terão de ser determinados. Em nossas mãos PPEP-1 produz constantemente cristais solidamente incorpora-. Assim, desenvolvemos um procedimento de optimização para produzir cristais de difracção de qualidade individuais de PPEP-1. Neste protocolo, descrever em detalhes a solução de produção, purificação, cristalização e estrutura da PPEP-1 14. Utilizamos a expressão intracelular em Escherichia coli de uma variante PPEP-1 sem a sequência de sinal de secreção, cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho, com a remoção do marcador de purificação, seguido por microdispersão 16 para uma tela de optimização e a determinação da estrutura por meio de zinco-comprimento de onda único de dispersão anómala (zinco-SAD) 17. Este protocolo pode ser adaptado para a produção e a estrutura determinação de outras proteínas (por exemplo, </ Em> metaloproteases) e, em particular, para as proteínas produtoras de cristais solidamente incorpora-. No pedido, DNA plasmídeo da construção (pET28a-NHis-rPPEP-1) e dados de difração pode ser fornecida para finalidades educacionais.
Cristalografia de raios-X ainda é o método mais rápido e mais preciso para determinar tridimensionais estruturas de resolução de quase-atómicas de proteínas 28. No entanto, isso exige o crescimento dos cristais individuais bem ordenadas. Estes são muitas vezes difíceis de obter e estado cristalino é artificial. No entanto, uma comparação de estruturas de proteína determinada por cristalografia de raios-X com os determinados por outros métodos, especialmente RMN, mostra geralmente uma boa concord…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a equipe do X06DA beamline na Fonte de Luz suíço, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suíça para a sustentação durante a coleta de dados síncrotron. Somos gratos a Monika Gompert para excelente suporte técnico. O projecto foi apoiado pela Universidade de Colónia e conceder INST 216 / 682-1 fugg do Conselho de Investigação alemã. A bolsa de doutoramento da Escola de Pós-Graduação Internacional em Saúde Desenvolvimento e Doença de CP é reconhecido. A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão No. 283570 (BioStruct-X).
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |