Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
クロストリジウム・ディフィシルは、院内抗生物質関連下痢症の感染1の主要な原因の1つです。このグラム陽性嫌気性細菌は、糞口経路を介して、その胞子の形を介して送信されます。過去十年間で、新しい''流行''または''の超''株( 例えば BI / NAP1 / 027)北米、欧州2の新規感染と死亡率の大幅な増加を引き起こしました。 C.ディフィシル -関連疾患(CDAD)は、高い致死率3との生活を脅かす大腸の炎症です。症状は、下痢4から偽膜性大腸炎5、しばしば致命的な中毒性巨大結腸6の範囲です。
毒性株が多剤耐性であり、再発率が7高いほどCDADの治療は困難です。抗生物質メトロニダゾール、fidaxomicinまたはバンコマイシンが含まれる、またはrepetitiのモーメント療法でvely再発例の糞便細菌叢移植。新しい治療戦略が緊急に8を必要とされています。いくつかの進展がC.ディフィシル毒素B 9をターゲットに 、治療用モノクローナル抗体Bezlotoxumabとして記録され、最近成功した第III相臨床試験を通過し、FDAやEMAと承認のために提出されました。さらに、新たな抗生物質は臨床試験10の異なる段階で、現時点ではテストされています。
効果的な治療法を開発するために新たな治療標的を識別しなければなりません。ノックアウト株におけるPPEP-1の欠如がCの病原性を減少させるように、そのような有望な標的である最近C.ディフィシルプロテアーゼプロリン-プロリンエンドペプチダーゼ-1(;; CD2830 / Zmp1 EC 3.4.24.89 PPEP-1)が発見されました生体内 11インチ ディフィシル 。 PPEP-1は、それらのC末端で2 C.ディフィシルアドヘシンを切断分泌型メタロプロテアーゼ12,13で13こうして付着bacterを解放人間の腸上皮からIA。したがって、 クロストリジウム・ディフィシルの固着性と運動性の表現型の間のバランスを維持することに関与しています。 PPEP-1に対する選択的阻害剤を開発するために、それはその3次元構造の詳細な知識が不可欠であるその基質を認識する方法を理解します。私たちは、基質ペプチド14でPPEP-1単独および複合体中の第1の結晶構造を解決しました。 PPEP-1は、2プロリン残基15との間に選択的に切断ペプチド結合最初の既知のプロテアーゼです。それは二重ねじれた方法で基板を結合し、プロテアーゼ活性部位14をカバーする S-ループに位置する残基の延長脂肪族-芳香族、ネットワークを介して、それを安定化させます。この基質結合モードはPPEP-1に固有のものであり、現在までに人間のプロテアーゼには見られません。これは有望な薬物標的になり、および阻害剤のオフターゲット効果は非常に低いです。
選択PPEP-1 INHを開発し、画面に将来的にibitors純粋な単分散PPEP-1タンパク質を多量に必要とされます。また、第一の阻害剤の結合様式を決定するために、PPEP-1との共結晶構造が決定されなければなりません。私たちの手でPPEP-1は常に相互成長結晶を生成します。したがって、私たちはPPEP-1の単一回折品質の結晶を生成するために最適化手順を開発しました。このプロトコルでは、我々は詳細にPPEP-1 14の生産、精製、結晶化および構造ソリューションについて説明します。我々は、亜鉛単一波長異常分散を介して最適化画面と構造決意に16 microseeding続く精製タグの除去と分泌シグナル配列、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを欠くPPEP-1変異体の大腸菌における細胞内発現を使用します(亜鉛-SAD)17。このプロトコルは、他のタンパク質( 例えば 、の産生および構造決意に適合させることができます</ em>のメタロプロテアーゼ)と相互成長結晶の製造タンパク質について、特にインチリクエストに応じて、構築物(をpET28a-NHIS-rPPEP-1)のプラスミドDNAおよび回折データは、教育目的のために提供することができます。
X線結晶学は、依然としてタンパク質28の3次元近接原子分解能構造を決定するための最速かつ最も正確な方法です。しかし、十分に秩序単結晶の成長を必要とします。これらは、多くの場合、取得するのが困難であり、結晶状態は、人工的です。しかしながら、他の方法によって決定されたもので、X線結晶学によって決定されるタンパク質構造の比較は、特にNMR、一般的に非常に良?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、シンクロトロンデータ収集時のサポートのためのスイスの光源、ポールシェラー研究所、Villigen、スイスでのビームラインX06DAのスタッフに感謝します。私たちは、優れた技術サポートのためのモニカGompertに感謝しています。プロジェクトはケルン大学でサポートされているとドイツの研究評議会からINST 216/682から1 FUGGを付与しました。 CPの開発健康と疾病の国際大学院から博士課程の交わりが認められています。これらの結果につながる研究は、助成金の契約番号283570(BioStruct-X)の下で欧州共同体のセブンス枠組み計画(FP7 / 2007年から2013年)から資金提供を受けています。
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |