Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Clostridium difficile est l' une des principales causes de diarrhées infections associées aux antibiotiques nosocomiales 1. Cette bactérie anaérobie à Gram positif est transmis par sa forme de spores par voie fécale-orale. Dans la dernière décennie, le nouveau '' épidémie '' ou '' hypervirulent '' souches (par exemple BI / NAP1 / 027) a provoqué une augmentation drastique des nouvelles infections et des taux de mortalité en Amérique du Nord et en Europe 2. C. maladie -Associated difficile (DACD) est un danger pour la vie du côlon inflammation avec des taux de létalité élevés 3. Les symptômes vont de la diarrhée 4 à la colite pseudomembraneuse 5 et le mégacôlon toxique souvent mortelle 6.
Le traitement de la DACD est difficile , car les souches virulentes sont multirésistante et le taux de récidive est élevé 7. A la thérapie de couple comprend le métronidazole antibiotiques, fidaxomicine ou vancomycine, ou repetiticas récurrents de transplantation fécale vement du microbiote. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont nécessaires d' urgence 8. Certains progrès sont enregistrés en tant que thérapeutique anticorps monoclonal Bezlotoxumab, ciblant la toxine C. difficile B 9, a récemment passé avec succès la phase III des essais cliniques et a été soumis à l' approbation de la FDA et de l' EMA. En outre, les nouveaux antibiotiques sont testées à l'heure actuelle à différents stades d'essais cliniques 10.
Pour développer un traitement efficace de nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiés. Récemment découvert C. protease difficile endopeptidase-1 proline-proline (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; CE 3.4.24.89) est une cible prometteuse, comme le manque de PPEP-1 dans une souche de knock-out diminue la virulence de C . difficile in vivo 11. PPEP-1 sécrété est une métalloprotéase 12,13 cliver deux adhésines de C. difficile à leur extrémité C-terminale 13 libérant ainsi l'adhérence bacterentre autres de l'épithélium de l'intestin humain. Par conséquent, il est impliqué dans le maintien de l'équilibre entre le phénotype et sessiles motiles de C. difficile. Pour développer des inhibiteurs sélectifs contre PPEP-1 et de comprendre comment il reconnaît ses substrats connaissance intime de sa structure tridimensionnelle est indispensable. Nous avons résolu la première structure cristalline de PPEP-1 seul ou en complexe avec un peptide substrat 14. PPEP-1 est la première protéase connue qui clive sélectivement les liaisons peptidiques entre les deux résidus de proline 15. Elle lie le substrat d'une manière double entortillé et stabilise via un réseau étendu aliphatique-aromatique de résidus situés dans le S-boucle qui couvre le site actif de la protéase 14. Ce mode de liaison au substrat est unique à PPEP-1 et ne trouve pas dans les protéases humaines à ce jour. Cela en fait une cible de médicament prometteur, et les effets hors-cible des inhibiteurs très improbables.
Pour développer et écran sélective PPEP-1 inhibitors à l'avenir, une grande quantité de pur et monodisperse PPEP-1 protéine est nécessaire. En outre, pour déterminer le mode de liaison des premiers inhibiteurs, des structures co-cristallines avec PPEP-1 devra être déterminée. Dans nos mains PPEP-1 produit constamment cristaux enchevêtrés. Ainsi, nous avons mis au point une procédure d'optimisation pour produire des cristaux simples Diffraction qualité de PPEP-1. Dans ce protocole , nous décrivons en détail la solution de PPEP-1 14 production, la purification, la cristallisation et de la structure. Nous utilisons l' expression intracellulaire dans Escherichia coli d'une variante PPEP-1 dépourvu de la séquence signal de sécrétion, une Chromatographie d' affinité et Chromatographie d'exclusion de taille avec l' enlèvement de l'étiquette de purification, suivie microseeding 16 dans un écran d'optimisation et la détermination de la structure par l' intermédiaire du zinc longueur d' onde unique dispersion anormale (zinc-SAD) 17. Ce protocole peut être adapté pour la production et la détermination de la structure d'autres protéines (par exemple </ Em> métalloprotéases) et en particulier pour les protéines produisant des cristaux enchevêtrés. Sur demande, l'ADN plasmidique de la construction (pET28a-NHis-rPPEP-1) Les données de diffraction et peut être fourni à des fins éducatives.
Cristallographie aux rayons X est encore la méthode la plus rapide et la plus précise pour déterminer trois dimensions des structures de résolution quasi atomique de protéines 28. Cependant, il nécessite la croissance de monocristaux bien ordonnées. Ceux-ci sont souvent difficiles à obtenir et l'état cristallin est artificiel. Toutefois, une comparaison des structures protéiques déterminées par cristallographie aux rayons X avec celles déterminées par d'autres méthodes, en particulier R…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le personnel du X06DA de ligne de lumière à la Source de Lumière Suisse, Paul-Scherrer Institut, Villigen, en Suisse pour le soutien lors de la collecte de données de synchrotron. Nous sommes reconnaissants à Monika Gompert pour un excellent support technique. Le projet a été soutenu par l'Université de Cologne et accorder INST 216 / 682-1 FUGG du Conseil de recherche allemand. Une bourse de doctorat de la Graduate School internationale en santé et développement des maladies à CP est reconnu. Les recherches menant à ces résultats ont reçu un financement du septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) en vertu de la convention de subvention n ° 283570 (BioSTRUCT-X).
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |