Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Difficile Clostridium הוא אחד הגורמים העיקריים של זיהומי שלשולים אנטיביוטיים הקשורים nosocomial 1. גראם חיובי זה חיידק אנאירובי מועבר באמצעות טופס הנבג שלה באמצעות מחזור הצואה-פה. בעשור האחרון, החדשה '' המגפה '' או '' hypervirulent '' זנים (למשל BI / NAP1 / 027) גרמו לעלייה דרסטית זיהומים חדשים ושיעורי תמותה בצפון אמריקה ובאירופה 2. C. difficile מחל -associated (CDAD) הנה דלקת מעי גסת סכנת חיים עם שיעורי תמותה גבוהים 3. הסימפטומים נעו בין שלשול 4 קוליטיס pseudomembranous 5 ואת megacolon הרעיל לעתים קרובות הקטלן 6.
טיפול CDAD קשה כמו הזנים האלימים הם multidrug עמיד ושיעור ההישנות גבוה 7. באותו טיפול רגע כולל את metronidazole אנטיביוטיקה, fidaxomicin או ונקומיצין, או repetitiבמקרי vely חוזרים השתלת חיידקים בצואה. אסטרטגיות טיפוליות חדשות נדרשות 8 בדחיפות. התקדמות מסוימת זו נרשמת Bezlotoxumab נוגדנים חד שבטיים טיפולית, מיקוד הרעלן difficile ג B 9, עברה בהצלחה לאחרונה שלב III של הניסויים הקליניים ואת הוגש לאישורו עם ה- FDA ו- EMA. בנוסף, אנטיביוטיקות חדשות נבדקות כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים 10.
כדי לפתח טיפול יעיל מטרות טיפוליות חדשות חייבות להיות מזוהות. שהתגלו לאחרונה C. difficile פרוטאז פרולין-פרולין endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) הוא יעד כזה מבטיח, כמו חוסר PPEP-1 זן נוק-אאוט פוחתת ארסיות של C . difficile in vivo 11. PPEP-1 הוא metalloprotease מופרש 12,13 ביקוע השני adhesins C. difficile ב C- הסופית שלהם 13 ובכך משחרר את bacter החסידIA מן האפיתל במעי האדם. לכן, הוא עוסק בשמירה על האיזון בין פנוטיפ הנייח ו ניע של difficile ג. כדי לפתח מעכבי סלקטיבית נגד PPEP-1 ו להבין איך היא מכירה מצעים שלה ידע אינטימי של מבנה תלת-ממדי שלו היא הכרחית. פתרנו את המבנה הגבישי הראשון של PPEP-1 לבד בקומפלקס עם פפטיד מצע 14. PPEP-1 הוא פרוטאז הראשון הידוע כי אג"ח המסלקת פפטיד סלקטיבי בין שתי שאריות פרולין 15. הוא נקשר המצע באופן פעמי מפותל ומייצב אותו דרך רשת אליפטיות-ארומטיים מורחבת של שאריות הממוקמות S-הלולאה המכסה את האתר הפעיל פרוטאז 14. מצב המצע מחייב זו הנו ייחודי PPEP-1 ולא נמצא פרוטאזות אדם עד כה. זה עושה את זה יעד תרופה הבטיח, ואת מחוץ יעד השפעות של מעכבים מאוד לא סבירים.
כדי לפתח מסך סלקטיבית Inh PPEP-1ibitors בעתיד כמות גדולה של חלבון טהור monodisperse PPEP-1 הוא זקוק. יתר על כן, על מנת לקבוע את המצב של עקדת המעכבים הראשונים, מבני שיתוף קריסטל עם PPEP-1 יצטרך להיקבע. בידיים שלנו PPEP-1 מייצר גבישים intergrown כל הזמן. לכן פתחנו הליך אופטימיזציה לייצר גבישים עקיפים באיכות יחידה של PPEP-1. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרוטרוט את הייצור, טיהור, פתרון התגבשות ומבנה PPEP-1 14. אנו משתמשים בביטוי תאי coli Escherichia של גרסה PPEP-1 חסרת רצף אות הפרשה, כרומטוגרפיה זיקת כרומטוגרפיה הדרת גודל עם הסרת תג הטיהור, ואחריו microseeding 16 אל תוך מרקע אופטימיזציה קביעת מבנה באמצעות פיזור יחיד גל אבץ האנומלי (אבץ-SAD) 17. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לקביעת ייצור ומבנה של חלבונים אחרים (למשל </ Em> metalloproteases) ובמיוחד עבור חלבונים לייצר גבישים intergrown. על פי בקשה, פלסמיד דנ"א של המבנה (pET28a-Nhis-rPPEP-1) ונתונים עקיפים יכולים להינתן למטרות חינוכיות.
X-ray crystallography is still the fastest and most accurate method to determine three-dimensional near-atomic resolution structures of proteins28. However, it requires the growth of well-ordered single crystals. These are often difficult to get and the crystalline state is artificial. However, a comparison of protein structures determined by X-ray crystallography with those determined by other methods, especially NMR, shows generally a very good agreement. In the case of PPEP-1, an NMR structure published rec…
The authors have nothing to disclose.
We thank the staff at the beamline X06DA at the Swiss Light Source, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Switzerland for support during synchrotron data collection. We are grateful to Monika Gompert for excellent technical support. The project was supported by the University of Cologne and grant INST 216/682-1 FUGG from the German Research Council. A PhD fellowship from the International Graduate School in Development Health and Disease to C.P. is acknowledged. The research leading to these results has received funding from the European Community's Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) under grant agreement No. 283570 (BioStruct-X).
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |