Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Clostridium difficile is een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale antibiotica geassocieerde diarree infecties 1. Dit Grampositieve anaërobe bacterie wordt via de sporenvorm via de fecaal-orale route. In de afgelopen tien jaar, nieuwe '' epidemie '' of '' hypervirulent '' stammen (bv BI / NAP1 / 027) veroorzaakte een drastische toename van nieuwe infecties en fataliteit prijzen in Noord-Amerika en Europa 2. C. difficile-geassocieerde ziekte (CDAD) is een levensbedreigende darm ontsteking met een hoge fataliteit tarieven 3. De symptomen variëren van 4 tot diarree pseudomembraneuze colitis 5 en de vaak fatale toxisch megacolon 6.
Behandeling van CDAD is moeilijk als de virulente stammen zijn multiresistente en de herhaling is hoog 7. Momenteel therapie omvat antibiotica metronidazol, fidaxomicine of vancomycine, of repetititief terugkerende gevallen fecale microbiota transplantatie. Nieuwe therapeutische strategieën zijn dringend nodig 8. Er is enige vooruitgang is geboekt als het therapeutische monoklonaal antilichaam Bezlotoxumab, gericht op C. difficile toxine B 9, heeft onlangs met succes geslaagd voor fase III klinische studies en is ingediend voor goedkeuring bij de FDA en EMA. Daarnaast worden nieuwe antibiotica getest momenteel in verschillende stadia van klinische proeven 10.
Om een effectieve behandeling van nieuwe therapeutische doelen moeten worden geïdentificeerd ontwikkelen. De recent ontdekte C. difficile protease proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) is een dergelijk veelbelovend doelwit, het gebrek aan PPEP-1 in een knock-out stam vermindert virulentie van C . difficile in vivo 11. PPEP-1 is een uitgescheiden metalloprotease 12,13 splitsen twee C. difficile adhesinen hun C-terminus 13 waardoor aldus de hechtende bacteria van de menselijke darm epitheel. Daarom wordt betrokken bij het handhaven van het evenwicht tussen de vastzittende en beweeglijke fenotype van C. difficile. Om selectieve remmers te ontwikkelen tegen PPEP-1 en te begrijpen hoe het haar substraten erkent intieme kennis van de driedimensionale structuur is onontbeerlijk. We hebben loste het eerste kristalstructuur van PPEP-1 alleen en in complex met een substraat peptide 14. PPEP-1 is de eerste bekende protease dat selectief splitst peptidebindingen tussen twee prolineresten 15. Het bindt het substraat in een dubbelblinde wijze geknikte en stabiliseert via langere alifatisch-aromatische netwerk van residuen in de S-lus die de protease actieve plaats 14 omvat. Dit substraat bindingsmodus uniek is PPEP-1 en niet in menselijke proteasen date. Dit maakt het een veelbelovende drug target, en off-target effecten van remmers zeer onwaarschijnlijk.
Het ontwikkelen en het scherm selectieve PPEP-1 inwibitors in de toekomst een grote hoeveelheid zuiver en monodisperse PPEP-1 eiwit nodig. Teneinde voorts de wijze van binding van eerste remmers, co-kristalstructuren met PPEP-1 te bepalen zullen bepalen. In onze handen PPEP-1 produceert voortdurend vergroeide kristallen. Aldus hebben we een optimalisatieprocedure enkelvoudige diffractie kwaliteit kristallen van PPEP-1 kunnen produceren. In dit protocol beschrijven we in detail de productie, zuivering, kristallisatie en structuur oplossing van PPEP-1 14. We maken gebruik van intracellulaire expressie in Escherichia coli van een PPEP-1 variant ontbreekt de secretie signaalsequentie, affiniteitschromatografie en size exclusion chromatografie met het verwijderen van de zuivering tag, gevolgd door microseeding 16 in een optimalisatie scherm en structuurbepaling via zink single-golflengte afwijkende dispersie (zink-SAD) 17. Dit protocol kan worden aangepast voor productie en structuurbepaling van andere eiwitten (bv </ Em> metalloproteasen), en in het bijzonder voor de productie van eiwitten vergroeide kristallen. Op verzoek, plasmide-DNA van het construct (pET28a-NHis-rPPEP-1) en diffractie gegevens kunnen worden verstrekt voor educatieve doeleinden.
Röntgenkristallografie blijft de snelste en meest nauwkeurige manier vast driedimensionale omgeving-atomaire resolutie structuren van eiwitten 28. Het vereist echter de groei van geordende éénkristallen. Deze zijn vaak moeilijk te bereiken en de kristallijne toestand kunstmatig. Een vergelijking van eiwitstructuren bepaald met röntgenkristallografie met die bepaald met andere methoden, met name NMR, zich over het algemeen een goede overeenstemming. Bij PPEP-1, een NMR structuur onlangs gepubliceerd 2…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken het personeel bij de bundellijn X06DA bij de Zwitserse Light Source, Paul-Scherrer-Instituut, Villigen, Zwitserland voor ondersteuning tijdens het verzamelen van gegevens synchrotron. We zijn dankbaar voor Monika Gompert voor een uitstekende technische ondersteuning. Het project werd ondersteund door de Universiteit van Keulen en verlenen INST 216 / 682-1 FUGG van de Duitse Research Council. Een PhD beurs van de International Graduate School in Development Gezondheid en Ziekte aan CP wordt erkend. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen uit de Europese Gemeenschap Zevende Kaderprogramma (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr 283.570 (BioStruct-X).
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |