Intra-трахеи Администрация<em> Гемофильной</em> В мышиные модели для изучения Воспаление дыхательных путей
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
Здесь мы опишем подробную процедуру эффективно и непосредственно доставить гемофильной инфекции в нижних дыхательных путей у мышей. Показана процедура подготовки H. инокулята гриппа, внутри трахеи закапывания H. гриппа в легкие, коллекция бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ), анализ иммунных клеток в БАЛ и выделения РНК для дифференциального анализа экспрессии генов. Эта процедура может быть использована для изучения легких воспалительной реакции на любые бактерии, вирусы или грибы. Прямая трахеи инстилляции в основном предпочтительнее интраназального или аэрозольные ингаляции процедур, так как он более эффективно доставляет бактериального инокулята в нижних отделах дыхательных путей с меньшей неоднозначностью.
Introduction
Воспаление является основной иммунный механизм защиты против инфекционных агентов. Это способствует ликвидации патогенных микроорганизмов и ремонт поврежденной ткани. Это также облегчает восстановление до нормального здорового состояния 1. Тем не менее, дизрегуляции воспаление часто приводит к хроническим воспалительным заболеваниям 2. Воспаление дыхательных путей является начальным толчком для различных легочных заболеваний , таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма и легочный фиброз 3.
Нетипируемых (некапсулированного) гемофильной (NTHi) связан с хроническими верхней и нижней легочных воспалительных заболеваний 4,5. Это доминирующий вид , выделенные из нижних дыхательных путей у детей и взрослых с хронической обструктивной болезнью легких 4,6,7. Воспалительная реакция после NTHi инфекции характеризуется повышающей регуляции провоспалительных цитокинов (таких как TNF и IL-1 & beta;), и он опосредован бу митоген активированный протеин киназа (МАРК) и ядерный фактор-kB (NF-kB) через Toll-подобных рецепторов (TLRs) 8.
Мышиные модели являются очень полезными инструментами для анализа, лежащей в основе патологии легких воспалительного заболевания из-за наличия различных генов-дефицитных линий. Существует несколько методов были использованы для инокуляции живых / ослабленные бактерии и бактериальные продукты, в том числе интраназального закапывания и аэрозольного ингаляционного 9,10. Здесь мы демонстрируем внутри трахеи закапывания. Несмотря на то, используется менее часто, такой подход является более эффективным и высокой воспроизводимостью, из-за прямой доставки прививочного материала в нижних отделах дыхательных путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем уникальную и минимально инвазивные процедуры для инокуляции легких мышей с бактериальным патогеном легких. Показано, что эта процедура может быть использована для изучения функции различных генов с использованием мышей, которые дефицитны по генам воспалительных с…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Referências
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).
