Intratracheale toediening van<em> Haemophilus influenzae</em> In muismodellen om te studeren luchtwegontsteking
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
Hier hebben we een gedetailleerde procedure te beschrijven om efficiënt en rechtstreeks te leveren Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. We tonen de procedure voor het bereiden van H. influenzae entstof, intratracheale indruppeling van H. influenzae in de longen, het verzamelen van broncho-alveolaire lavage vloeistof (BALF), analyse van immuuncellen in de BALF en RNA-isolatie van differentiële genexpressie analyse. Deze procedure kan worden gebruikt om de long ontstekingsreactie op bacteriën, virussen of fungi. Direct tracheale instillatie wordt meestal de voorkeur boven intranasale of aërosol inhalatie procedures omdat het efficiënter levert het bacteriële inoculum in de onderste luchtwegen minder dubbelzinnigheid.
Introduction
Ontsteking is een fundamenteel immuun mechanisme van verdediging tegen infectieuze agentia. Het bevordert pathogeen uitroeiing en de reparatie van beschadigd weefsel. Het vergemakkelijkt ook het herstel naar een normale gezonde toestand 1. Echter, ontregelde ontsteking leidt vaak tot chronische ontstekingsziekten 2. Luchtwegontsteking een initiële trigger voor verschillende longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), astma en longfibrose 3.
De niet-typeerbare (ingekapseld) Haemophilus influenzae (NTHi) is geassocieerd met chronische bovenste en onderste long ontstekingsziekten 4,5. Het is de dominante species geïsoleerd uit de lagere luchtwegen van kinderen en volwassenen met chronische obstructieve longziekte 4,6,7. De ontstekingsreactie na NTHi infectie wordt gekenmerkt door de verhoogde expressie van pro-inflammatoire cytokinen (zoals TNF en IL-1β) en wordt gemedieerd by mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) en nucleaire factor-kB (NF-KB) door middel van toll-like receptoren (TLRs) 8.
Muis zijn zeer nuttige hulpmiddelen voor het analyseren van de onderliggende pathologie van long- ontsteking vanwege de beschikbaarheid van verschillende gen-deficiënte lijnen. Verscheidene methoden zijn voor levende / verzwakte bacteriën en bacteriële producten, waaronder intranasale instillatie en aërosol inhalatie 9,10 inoculeren. Hier tonen we intra-tracheale instillatie. Hoewel minder frequent gebruikt, deze benadering is efficiënter en zeer reproduceerbare vanwege de directe levering van het entmateriaal tot de onderste luchtwegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin wij een unieke en minimaal invasieve procedure beschrijft de longen van muizen te inoculeren met een bacteriële ziekteverwekker long. We tonen aan dat deze procedure kan worden gebruikt om de functie van verschillende genen bij muizen die deficiënt zijn in de genen van inflammatoire signaalroutes zijn bestuderen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de ontstekingsreacties op virale en fungale longinfecties bestuderen. De voordelen van deze werkwijze ten opzichte van andere werkwijzen zoals intranasale of a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Referências
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).
