Intratracheale Verabreichung von<em> Haemophilus influenzae</em> In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren , um effizient und direkt Haemophilus influenzae liefern in die unteren Atemwege von Mäusen. Wir zeigen das Verfahren zur Herstellung von H. influenzae Inokulum, intratracheale Instillation von H. influenzae in die Lunge, Sammlung von broncho-alveolären Lavage (BALF), Analyse von Immunzellen in der BALF und RNA – Isolation für Differentialgenexpressionsanalyse. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Lungenentzündungsreaktion auf alle Bakterien, Viren oder Pilze zu untersuchen. Direkt tracheale Instillation wird meist über intranasale oder Aerosolinhalationsverfahren bevorzugt, da es effizienter das bakterielle Inokulum in die unteren Atemwege mit geringer Mehrdeutigkeit liefert.
Introduction
Die Entzündung ist eine grundlegende Immunabwehrmechanismus gegen infektiöse Erreger. Es fördert die Erreger Beseitigung und Reparatur von beschädigtem Gewebe. Es erleichtert auch die Erholung zu einem normalen , gesunden Zustand 1. Jedoch führt dysregulated Entzündung oft zu chronischen entzündlichen Erkrankungen 2. Entzündung der Atemwege ist ein erster Auslöser für verschiedene Lungenerkrankungen wie chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Asthma und Lungenfibrose 3.
Die nicht-typisierbaren (nicht eingekapselten) Haemophilus influenzae (NTHi) mit chronischen oberen und unteren Lungenentzündungserkrankungen 4,5 verbunden. Es ist die dominante Spezies aus den unteren Atemwege von Kindern und Erwachsenen mit chronisch – obstruktiver Lungenerkrankung 4,6,7 isoliert. Die Entzündungsantwort nach der NTHi-Infektion wird durch die Hochregulation von proinflammatorischen Zytokinen (wie TNF und IL-1β) gekennzeichnet, und es wird vermittelt by Mitogen – aktivierte Proteinkinase (MAPK) und nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) über Toll-like Rezeptoren (TLR) 8.
Mausmodelle sind sehr nützliche Werkzeuge zur Analyse der zugrundeliegenden Pathologie der Lungenentzündungskrankheit aufgrund der Verfügbarkeit der verschiedenen Gen-defizienten Linien. Live / attenuierten Bakterien und bakterielle Produkte zu inokulieren, einschließlich intranasale Instillation und aerosolized Inhalations 9,10 mehrere Verfahren verwendet worden. Hier zeigen wir, intratracheale Instillation. Obwohl weniger häufig verwendet wird, ist dieser Ansatz effizienter und hoch reproduzierbare wegen der direkten Abgabe des Inokulums auf den unteren Atemwege.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine einzigartige und minimal-invasive Verfahren, um die Lungen von Mäusen, die mit einer bakteriellen Lungen Pathogen zu beimpfen. Wir zeigen, dass dieses Verfahren verwendet werden kann, um die Funktion der verschiedenen Gene zu untersuchen, die in Mäusen unter Verwendung von Genen von Entzündungssignalwege defizient sind. Dieses Verfahren kann auch die Entzündungsreaktionen gegen virale und fungale Infektionen der Lunge zu untersuchen verwendet werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenübe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Referências
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