We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
여기에 설명 된 실험 절차 유생 X.의 후각 기관의 라벨링 감각 뉴런을 허용 형광 결합 된 덱스 트란과 살아있는 동물에서 감각 축삭의 성장 이후의 시각화의 전기에 의해 laevis의. 생체 내 전기 천공의 파라미터를 변화시킴으로써 표지화 감각 뉴런의 수를 제어 할 수있다. 그것은 거의 또는 단일 셀 감각 상피의 신경 세포의 큰 그룹 레이블을 억제 할 수있는 효과가있다.
이 마이크로 피펫 특성과 전기 펄스에 대해 특히주의하는 것이 중요하다 신경 라벨의 확장 원하는 보장합니다. 높은 피펫 저항 및 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 반복 횟수의 감소는 더 광범위 라벨링 이어질 수 피펫 저항 및 높은 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 펄스의 개수를 감소시키는 반면, 표지화 된 세포의 양을 줄일 수있다. 목전기에 대한 형광 덱스 트란의 전자 사용은 적용되는 설정이 적절한 경우에 즉각적인 시각적 피드백을 제공합니다. 주의 그 진폭, 기간 및 잠재적으로 세포 손상으로 이어질이나 사망 17 셀 수있는 프로토콜에서 제공하는 값을 초과 펄스 수에 대한 매개 변수를 사용하여. 마이크로 피펫의 막힘 또는 파손 팁도 성공적으로 전기를 방해 할 수 있습니다.
X의 후각 기관에서 생체 전기에서 postmetamorphotic 개구리의 피부는 강인하고 쉽게 마이크로 피펫으로 침투 할 수 없기 때문에 laevis의 유생 단계로 제한됩니다. 신경 프로세스 생체 가시화 깊은 뇌 영역 또는 혈관에 의해 여기 / 발광 빛의 산란에 의해 방해 될 수있다. 이 문제는 더 큰 뇌에 더 높은 유생 단계에서 특히 분명하게 미세 축삭 프로세스의 명확한 식별이 더 어려워 노이즈 신호가 발생할 수 있습니다.
<p= "jove_content"> 제시된 프로토콜은 허가 클래스는 전체 세포 패치의 라벨처럼, 동물을 해부 라벨 동안 세포를 손상, 조직 슬라이스를 준비하거나 다른 방법에 필요한 조직을 고정하지 않고 그대로 후각 시스템의 감각 신경을 시각화 -clamp 실험 18. 생체 시간 경과 이미징 또는 몇 번의 감각 뉴런의 라벨링을 결합 할 때, 긴 시간 간격 동안 하나의 성숙한 감각 뉴런의 사구체 연결을 시각화 할 수있다. 이 방법은 여러 주 동안 미성숙 감각 뉴런의 축삭 돌기 패턴의 발전을 모니터 할 수도있다. 그것은 살아있는 동물에서 하나의 축삭의 성장 패턴을 모니터링 할 수 있습니다으로이 후자의 옵션은 특히 흥미 롭다. 이 축삭지도와 길 찾기를 제어 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수있는 가능성을 엽니 다. 후각 수용체 발현을 포함하여 여러 가지 요인, 각종 AXOn 개의 안내 분자 및 후각 감각 뉴런의 유도 / 운동량은 감각 신경 축삭 4,5의 목표 발견을 조절하는 것으로 나타났다.프로토콜 어플리케이션은 후각 감각 뉴런에 한정되지 않고, 또한 예를 들어, 다른 세포 유형을 연구하기 위해 적용될 수있다., 뇌 발달 또는 후각 망울의 승모판 세포의 신경성 영역 / 전구 줄기 세포. 또한 증명 기술은 또한 신경 세포 표지 및 / 또는 연결된 회로 7,19 대한 기능적 정보를 얻을 막 투과성 칼슘 염료를 칼슘 민감성 덱스 트란과 병용하거나 주입 할 수있다. 덱스 트란에 결합 된 형광 물질의 광범위한 이용 가능성은 복수의 개별 셀 또는 다른 색 개체군 표지를 허용한다. 또한 형광 단백질 예 인코딩 DNA 용액을, 플라스미드, 전기 천공에 적합하고 더욱 versatili을 향상시킬 수있다타이 및 기술 (6)의 유용성. 프로토콜은 또한 덱스 트란 및 DNA 또는 청구 morpholinos의 결합 된 전기는 유전자 발현 (13 및 17)를 조작 할 수 있도록 향상 될 수있다.
한 방법은 확실히 복잡하고 척추 동물의 후각 시스템의 축삭 지침을 조절 아직 완전히 이해되지 프로세스를 조사 할 수있는 새로운 도구를 나타냅니다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |