We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
La procédure expérimentale décrite ici permet l'étiquetage des neurones sensoriels de l'organe olfactif larvaire de X. laevis par électroporation de dextrans fluorophores couplés et la visualisation ultérieure de la croissance axonale sensorielle chez l'animal vivant. En faisant varier les paramètres de l'électroporation in vivo, il est possible de contrôler le nombre de neurones sensoriels marqués. Il est ainsi possible de marquer de grands groupes de neurones d'un épithélium sensoriel, très peu ou même des cellules individuelles.
Pour assurer le désire étendre l'étiquetage des neurones, il est important d'être particulièrement prudent sur les caractéristiques de micropipette et les impulsions d'électroporation. Des résistances plus élevées et la réduction de l'impulsion de tension d'amplitude, la durée et le nombre de répétitions pipette peut réduire la quantité de cellules marquées, tandis que la diminution des résistances de pipette et supérieur amplitude d'impulsion de tension, de durée et nombre d'impulsions peut conduire à un étiquetage plus répandue. ThE à utiliser des dextrans fluorescents pour l'électroporation fournit une rétroaction visuelle immédiate si les paramètres appliqués sont appropriés. Veillez à ce que l'aide de paramètres pour l'amplitude, la durée et le nombre d'impulsions qui dépassent les valeurs indiquées dans le protocole peut potentiellement conduire à des dommages cellulaires ou même la mort cellulaire 17. Conseils bouchés ou brisés de micropipettes peuvent également entraver l'électroporation réussie.
En électroporation in vivo dans l'organe olfactif de X. laevis est limitée aux stades larvaires depuis la peau de grenouille postmetamorphotic est difficile et ne peut pas être facilement pénétrée par une micropipette. La visualisation in vivo de processus neuronaux peut être entravé par la diffusion de la lumière d'excitation / d'émission dans les zones les plus profondes du cerveau ou de vaisseaux sanguins. Ce problème devient particulièrement évident dans les stades larvaires plus élevés en raison d'un plus grand cerveau et peut conduire à des signaux bruyants rendant l'identification claire des processus axonales fines plus difficile.
<pclass = "jove_content"> Permis Le protocole présenté à visualiser les neurones sensoriels du système olfactif intact sans disséquer l'animal, endommager les cellules pendant l'étiquetage, la préparation des tranches de tissu ou de fixer le tissu nécessaire pour des méthodes alternatives, comme l'étiquetage dans le patch cellule entière expériences -clamp 18. En combinant l'étiquetage de quelques simples ou neurones sensoriels avec in vivo laps de temps d'imagerie, il est possible de visualiser les connexions glomérulaire des neurones sensoriels matures célibataires de plus longs intervalles de temps. De cette façon, il est également possible de suivre l'évolution des modèles de projections axonales des neurones sensoriels immatures pendant plusieurs semaines. Cette dernière option est particulièrement intéressante car elle permet de surveiller les tendances d'axones simples de croissance chez l'animal vivant. Cela ouvre la possibilité d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le guidage axonal et pathfinding. Plusieurs facteurs, y compris l'expression du récepteur odorant, divers AxoIl a été démontré n molécules de guidage et induit odorant-/ activité spontanée des neurones sensoriels de réglementer la conclusion cible des axones des neurones sensoriels 4,5.L'application du protocole ne se limite pas aux neurones sensoriels olfactifs, mais peut également être appliquée à l'étude d'autres types de cellules, par exemple., Les cellules souches / progénitrices neurogènes des zones du cerveau en développement ou cellules mitrales du bulbe olfactif. En outre, la technique illustrée peut également être utilisé en combinaison avec le calcium ou des dextranes sensibles injecté colorants de calcium membrane perméable à obtenir des informations sur le fonctionnement des neurones marqués et / ou les circuits connectés 7,19. La disponibilité d'une large gamme de fluorophores couplés aux dextrans permet l'étiquetage de plusieurs cellules ou populations de différentes couleurs individuelles. Aussi plasmide solution d'ADN, par exemple codant pour des protéines fluorescentes, est adapté à l'électroporation et peut en outre améliorer la versatiliTy et l'utilité de la technique 6. Le protocole peut encore être amélioré pour permettre l'électroporation combiné de dextrans et de l'ADN ou morpholinos chargés de manipuler l'expression des gènes 13,17.
La méthode décrite représente certainement un nouvel outil pour étudier le processus complexe et pas encore pleinement compris qui régulent l'orientation des axones dans le système olfactif des vertébrés.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |